植物の高次生命現象における小胞輸送の機能解析

植物高等生命现象中囊泡运输的功能分析

基本信息

批准号：
15031228
负责人：
上田貴志
金额：
$ 3.58万
依托单位：
The University of Tokyo (2004)The Institute of Physical and Chemical Research (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15031228/
关键词：
Rab GTPase endocytosis SNARE Ara6 Ara7 Rha1 Vam3 Arabidopsis エンドソームエンドサイオーシス Rab5 シロイヌナズナ GNOM リサイクリング

项目摘要

Rab GTPaseは,GTP型とGDP型の構造変換を通し,輸送小胞が標的膜へと輸送される際の分子スイッチとして機能している.一般的に,GTPを加水分解しGDP型となったRab GTPaseは,再びGTP型へと活性化され,次のGTPase cycleをまわることになるが,この際のヌクレオチド交換反応には,GDP/GTP交換因子(GEF)と呼ばれる分子が必要であることが知られている.そこで,シロイヌナズナにおけるRab5グループの機能を明らかにするため,まずRab5のGEFの機能解析を試みた.他の生物において,Rab5のGEFはVps9 domainと呼ばれる保存された構造を持つことが報告されている.シロイヌナズナゲノム中でVps9 domainを有するタンパク質を探索したところ,Vps9 domainを有するタンパク質をコードする二つの遺伝子が見いだされた.そのうち,発現が確認された一つの遺伝子(AtVps9a)をクローニングし,精製タンパク質を用いてAra7に対するGEF活性を測定したところ,非常に強いGEF活性が検出された.また,in vitroでのpull-down assayにより,AtVps9がAra6,Ara7,Rha1の全てと結合することも明らかとなった.このことから,シロイヌナズナのRab5関連タンパク質は,その構造上の特異性に反し,いずれの分子もが同一のGEFにより制御されていることが示唆された.これが事実であれば,AtVPS9遺伝子が破壊された植物においては,Rab5グループの全ての分子が不活化していると考えられ,この変異体を解析することにより,植物におけるRab5グループの機能をその総和として解析することが可能であると期待される.現在この変異体の解析を進めているが,予備的な解析において胚発生のかなり初期より細胞形態に異常が見られることから,この遺伝子産物が発生の初期から必須の働きを担っているものと予測される.今後の生化学的,遺伝学的解析を通して,AtVps9の機能をさらに明らかに出来るものと期待している.atvps9変異体の解析に加え,各rab5変異体の解析も順調に進行している.既にara6,rha1変異体については戻し交雑を終え,2重変異体の作出も完了している.

当传输囊泡通过GTP型和GDP型结构转换传输到靶膜时，RAB GTPase充当分子开关。通常，将GTP水解为GDP型的RAB GTPase再次被激活为GTP型，然后通过下一个GTPase循环。众所周知，该核苷酸交换反应需要一种称为GDP/GTP交换因子（GEF）的分子。因此，为了阐明Rab5组在拟南芥中的功能，我们首先试图分析RAB5 GEF的功能分析。在其他生物体中，据报道，Rab5的GEF具有称为VPS9域的保守结构。当我们在拟南芥基因组中搜索具有VPS9结构域的蛋白质时，我们发现发现VPS9结构域已被发现。发现了编码蛋白质具有域的两个基因。克隆了一个被证实表达的基因（ATVPS9A），并使用纯化的蛋白质测量针对ARA7的GEF活性，并检测到非常强的GEF活性。另外，体外下拉。测定还显示ATVPS9与所有ARA6，ARA7和RHA1结合。这表明与拟南芥Rab5相关的蛋白质对其结构特异性具有抗性，并且所有分子均由相同的GEF调节。如果这是真的，人们认为在ATVPS9基因已被破坏的植物中，Rab5组中的所有分子都被灭活，并且通过分析该突变体，Rab5组在植物中的功能可以作为其功能的总和分析。预计这是可能的。我们目前正在对该突变体进行分析，但是在初步分析中，从胚胎发育的一开始就观察到了细胞形态的异常，并且可以预测该基因产物从发育开始开始起着至关重要的作用。我们希望可以通过未来的生化和遗传分析进一步揭示ATVPS9的功能。除了对ATVPS9突变体的分析外，对每个RAB5突变体的分析也顺利进行。 ARA6和RHA1突变体的反向交叉已经完成，并且还完成了双突变体的创建。