酸素濃度制御を利用したヒト多能性幹細胞のnaive化の検討

使用氧浓度控制检查人类多能干细胞的幼稚化

• 批准号: 16K18819
• 负责人: 宮崎 隆道
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16K18819/
• 关键词: naive; 低酸素培養; 間葉上皮転換; ヒト多能性幹細胞; 細胞・組織; 発生・分化

本研究では酸素制御による刺激と間葉上皮転換(MET)機構を組み合わせ、ヒト多能性幹細胞(hPSC)の効率的なnaive化を図ることを目的としている。研究は酸素条件の設定及びその条件下のhPSCにおけるエピジェネティック因子の変動の解析と、好適酸素条件下でのガン阻害剤低分子化合物ライブラリーからのnaive化に寄与する化合物のスクリーニングを年度毎に分け計画した。初年度は培養条件の作成に注力し、低酸素(2%～5%)処理後とその処理時間、化合物添加時を想定した播種密度の組合せの検討を行い、ヒストン修飾関連酵素の遺伝子発現の増減を定量PCRで比較した。結果として低酸素濃度ほど発現量が上昇する傾向があり、hPSCが低密度かつfeeder-free条件下での長時間処理では細胞死を招きやすいことが判明した。同時にパウチパック/低酸素調節剤を用いた更なる低酸素条件(≦1%)の検討を行ったが、播種条件と処理時間を厳密に調整する必要があり、最適酸素濃度条件の決定には至らなかった。一方で、遺伝子発現制御によるMETを合せて進め、METに関連する遺伝子の過剰発現と低酸素状態の同時処理によるnaive化の可否を検討した。E-cadherin過剰発現ヒトES細胞株を作成し、通常酸素濃度と低酸素濃度(2%)下でE-cadherinを過剰発現させ比較したところ、低酸素条件下でよりコンパクトでタイトなコロニーを形成し、また遺伝子発現を調べた結果ではnaive関連遺伝子の発現が上昇することが判明した。しかしその発現は既報値ほど増加せず、またE-cadherinの過剰発現量もやや制限的であったため、遺伝子導入株のクローニングを行い再施行する必要があると判断した。研究者の退職により本研究は廃止されるが、今後更に至適酸素条件を確定することで、確実なnaive化が実現されると考える。

The aim of this study is to stimulate mesenchymal epithelial cell (MET) formation and differentiation of pluripotent stem cells (hPSC). To study the setting of acid conditions and the analysis of the change of hPSC factor under different conditions, and to study the annual sub-plan of the change of hPSC factor under different acid conditions. In the beginning of the year, the concentration of culture conditions, the treatment time after treatment with low acid (2%~5%), the time of compound addition, the combination of seeding density, the increase of gene expression of modified enzymes and quantitative PCR were compared. The results showed that the concentration of hPSC increased significantly under low density and feed-free conditions, and the cell death rate increased significantly under long-term treatment. At the same time, it is necessary to adjust the planting conditions and treatment time carefully, and determine the optimum acid concentration condition. To investigate the possibility of MET integration for the simultaneous processing of gene generation and low acid state in a single cell. E-cadherin over-expression was observed in ES cell lines prepared at normal and low acid concentrations (2%). Compared with normal and low acid concentrations, E-cadherin over-expression was observed in ES cell lines. For example, if the value of the E-cadherin is increased, the E-cadherin will be reduced. This study was conducted to determine the appropriate conditions for the study and to confirm the initial results.