トマト黄化えそウイルス各種タンパク質の相互作用様式解明

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本年度は，トマト黄化えそウイルス (TSWV) がコードする各タンパク質の内，RNAポリメラーゼ（Lタンパク質），細胞間移行蛋白質（NSm)，およびサイレンシングサプレッサータンパク質（NSs）に関して，大腸菌を用いた発現系の構築を行った．TSWVのLタンパク質は，330kDaと非常に巨大であり，全長では発現させることが不可能であった．そこで，Lタンパク質のORFを4分割し，それぞれの領域の発現を試みた．結果的に，いくつかの領域で発現が確認されたものの，いずれも不溶性画分に分画されてしまった．今後，さらに細かい領域に分割し，可溶性タンパク質として発現可能な領域を探索する必要がある．NSmタンパク質に関しては，35kDaと比較的小さいタンパク質であるため，全長で発現可能であると思われたが，残念ながら大部分が不溶性画分へと分画されてしまった．そのため，このNSmタンパク質についても，可溶性タンパク質として発現される領域を探索する必要がある．一方，NSsタンパク質に関しては，ヒスタグ・チオレドキシンタグを融合させることで，可溶性タンパク質として発現させることに成功した．その後，ニッケルレジンによる精製，ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製にも成功し，純度の高いNSsタンパク質を大量に精製することが出来た．5mg/mLのタンパク質濃度で結晶化を試みたが，現在のところ，X線構造解析が可能な良質の結晶は得られていない．今後，精製条件や結晶化条件の詳細な検討を行う必要がある．