ヒトES/iPS細胞から筋衛星細胞への分化誘導法の確立

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本研究は血清や血清置換物を使用せずにヒト多能性幹細胞から筋衛星細胞へ効率良く文か誘導する方法を確立することを目的としている。H1, HES-3, IMR90-1, 201B7, KhES-3の5種類のヒト多能性幹細胞を使用してPAX3とPAX7の発現が高くなる株の選定及び分化誘導法の検討を行った。ヒト多能性幹細胞は分化能も株により異なるため、リアルタイムPCRを使用してPAX3/PAX7発現を株毎に評価した。分化誘導前と分化誘導後のPAX3とPAX7発現量をリアルタイムPCRで定量的に測定した。５種類のヒト多能性幹細胞株の中で、分化誘導したHES-3においてPAX3とPAX7の発現量が分化誘導前よりも４０～５０倍高くなった。この結果から分化誘導法を確立するためにはHES-3（雌）を使用してPAX3, PAX7のレポーター細胞を作製することが効果的であると考えられた。本研究の目標の１つである筋肉細胞の移植医療の対象となるデシュンヌ型筋ジストロフィーは男児に多く発症する疾患である。従って筋衛星細胞への分化方法の確立は理想的には雄のヒト多能性幹細胞を使用して進めるのが良いと考えられる。これらのことからHES-3, KhES-3（雄）, H1（雄）株を使用してレポーター細胞を作製することにした。次にレポーター細胞の構築のためのプラスミド作製を行った。CRISPR でのKnockinを利用してヒト多能性幹細胞のレポーター細胞を作製のため行う予定だったが、効率的かつ遺伝子方向も決めてKnock-inが行えるCRISPR-PITCH法が報告された。私達は複数の株で複数レポーター細胞作製を計画しており、より改善された方法でレポーター細胞作製を行うことは時間短縮になると考えCRISPR-PITCHを採用することにした。このレポーター細胞作製計画の変更のため、作製完了には至らなかった。