心筋細胞の発生機序の解析とその分化誘導方法の開発及び障害心への定着

分析心肌细胞的发育机制，开发诱导其分化的方法以及在受损心脏中的定植

• 批准号: 08877109
• 负责人: 山崎 力
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877109/
• 关键词: 心筋細胞; ES細胞; MAPキナーゼ; Csx; raf1; ras; GATA-4; MEF2C

心筋細胞分化におけるMAPKカスケードの役割をin vitroで心筋細胞に分化する未分化胚細胞(ES細胞)を用い検討した。すなわち、ES細胞を浮遊培養すると、細胞集塊(embryoid body、EB)を形成し、心筋細胞に分化する。分化初期に相当する浮遊培養開始後3日目に心臓の発生に必須の組織特異的転写因子のCsxのプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を結合したレポータープラスミド(Csx-luc)とともにMAPKカスケードを特異的に阻害あるいは活性化するdominant negative(DN)ras、constitutive(CA)ras、 DNAraf1、CA raf1、DN MEK、CA MEK、DN MAPKの発現ベクターを遺伝子導入し、Csxの転写活性に与える影響を検討した。また、MAPKフォスターゼであるCL100を過剰発現させ、MAPKカスケードを抑制したES細胞のcell lineを樹立、分化させ、顕微鏡による観察での拍動の割合、心筋分化に重要な組織特異的転写因子であるGATA-4、MEF2Cの発現を検討した。また、ミオシンの発現を抗ミオシン抗体MF-20による免疫蛍光染色法で解析した。その結果、Csx-luc活性はDN rasで完全に抑制され、DN raf1、DN MEK、DN MAPKで約20%に低下した。一方、CA ras、CA raf1、CA MEKではその活性は上昇した。Wild type EBが40〜50%の拍動を示したのに対しCL100過剰発現細胞は拍動が停止し、ミオシンの発現は10%以下に抑制された。しかし、GATA-4、MEF2Cの発現量は変わらなかった。以上より、MAPKカスケードが心筋細胞の分化に重要であることが示された。MAPKカスケードがCsxのプロモーター活性に重要であった一方、GATA-4、MEF2Cの発現には影響がなく、MAPKカスケードが組織特異的転写因子のレベルで心筋分化に関わっている可能性が示唆された。

MAPK cell differentiation and cell culture in vitro and differentiation of undifferentiated embryonic cells (ES cells) in vitro Cell culture, embryo body (EB) formation, and differentiation of cardiac muscle cells At the beginning of differentiation, 3 days after the start of plankton culture, the tissue-specific transcription factors necessary for the development of the heart were combined with the dominant negative(DN)ras, constitutive(CA)ras, DNA raf 1, CA raf1, DN MEK, CA MEK, and DN MAPK. Csx's writing activity and influence are discussed. In addition, the expression of CL100, MAPK protein, MAPK protein, and MEF2C in ES cells was also investigated. The detection of anti-inflammatory antibodies MF-20 was analyzed by immunofluorescence staining. As a result, Csx-luc activity was completely inhibited by DN ras, and DN raf1, DN MEK and DN MAPK activity were decreased by about 20%. One side, CA ras, CA raf1, CA MEK Wild type EB: 40 ~ 50% of the beat is detected, and CL100 is detected. The beat is stopped, and the detection is suppressed by 10% or less. GATA-4, MEF2C and the amount of discovery are not clear. The above mentioned MAPK is very important for the differentiation of cardiac muscle cells. MAPK activity is important for Csx expression, GATA-4 and MEF2C expression, and it is possible for MAPK activity to influence tissue specific expression factors in the differentiation of cardiac muscle.

项目成果

Yamazaki T.et al: "Stretching the evidence in the case of cardiac growth." Cardiovasc.Res.31(4). 493-498 (1996)

Yamazaki T.et al：“在心脏生长的情况下扩展证据。”

Shiojima I., Komuro I.etd: "Assignment of cardiac homeobox gene CSX to human chromosome 5q34." Genomics. 27. 204-206 (1995)

Shiojima I.、Komuro I.etd：“将心脏同源盒基因 CSX 分配给人类染色体 5q34。”

Yamazaki T.et al: "Molecular cloning and characterization of human cardiac homeobox gene CSX1." Circ.Res.79. 920-929 (1996)

Yamazaki T.et al：“人类心脏同源盒基因 CSX1 的分子克隆和表征。”