心筋細胞の発生機序の解析とその分化誘導方法の開発及び障害心への定着

分析心肌细胞的发育机制，开发诱导其分化的方法以及在受损心脏中的定植

基本信息

批准号：
08877109
负责人：
山崎力
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08877109/
关键词：
心筋細胞 ES細胞 MAPキナーゼ Csx raf1 ras GATA-4 MEF2C

项目摘要

心筋細胞分化におけるMAPKカスケードの役割をin vitroで心筋細胞に分化する未分化胚細胞(ES細胞)を用い検討した。すなわち、ES細胞を浮遊培養すると、細胞集塊(embryoid body、EB)を形成し、心筋細胞に分化する。分化初期に相当する浮遊培養開始後3日目に心臓の発生に必須の組織特異的転写因子のCsxのプロモーターにルシフェラーゼ遺伝子を結合したレポータープラスミド(Csx-luc)とともにMAPKカスケードを特異的に阻害あるいは活性化するdominant negative(DN)ras、constitutive(CA)ras、 DNAraf1、CA raf1、DN MEK、CA MEK、DN MAPKの発現ベクターを遺伝子導入し、Csxの転写活性に与える影響を検討した。また、MAPKフォスターゼであるCL100を過剰発現させ、MAPKカスケードを抑制したES細胞のcell lineを樹立、分化させ、顕微鏡による観察での拍動の割合、心筋分化に重要な組織特異的転写因子であるGATA-4、MEF2Cの発現を検討した。また、ミオシンの発現を抗ミオシン抗体MF-20による免疫蛍光染色法で解析した。その結果、Csx-luc活性はDN rasで完全に抑制され、DN raf1、DN MEK、DN MAPKで約20%に低下した。一方、CA ras、CA raf1、CA MEKではその活性は上昇した。Wild type EBが40〜50%の拍動を示したのに対しCL100過剰発現細胞は拍動が停止し、ミオシンの発現は10%以下に抑制された。しかし、GATA-4、MEF2Cの発現量は変わらなかった。以上より、MAPKカスケードが心筋細胞の分化に重要であることが示された。MAPKカスケードがCsxのプロモーター活性に重要であった一方、GATA-4、MEF2Cの発現には影響がなく、MAPKカスケードが組織特異的転写因子のレベルで心筋分化に関わっている可能性が示唆された。

使用未分化的生殖细胞（ES细胞）研究了MAPK级联反应在心肌细胞分化中的作用，这些生殖细胞（ES细胞）在体外分化为心肌细胞。也就是说，当ES细胞以悬浮液培养时，细胞簇（EB）形式并区分为心肌细胞。悬浮培养开始后的第三天，与差异化的开始相对应，我们介绍了主要负（DN）RAS，组成型（CA）RAS，DNARAF1，CA RAF1，DN MEK，CA MEK，CA MEK和DN MAPK的表达矢量，该表达式与MAPK CASCADE（CASCADE the reporer tho）构成了centexxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx的cosxxxxxxcalse thosx-clist-clissx-clissx-cliss-clismid（c） CSX的启动子是心脏发育必不可少的组织特异性转录因子，并研究了对CSX转录活性的影响。此外，我们建立了过表达MAPK FOSTASE CL100的ES细胞的细胞系，并抑制了MAPK级联反应，并检查了微观观察时的Beats速率，以及GATA-4和MEF2C的表达，对心肌分化的组织特异性转录因子很重要。此外，使用抗肌球蛋白抗体MF-20通过免疫荧光染色分析肌球蛋白表达。结果，DN RAS完全抑制了CSX-LUC活性，并用DN RAF1，DN MEK和DN MAPK降低至约20％。另一方面，CA RAS，CA RAF1和CA MEK的活动增加了。野生型EB显示40-50％的节拍，而CL100过表达的细胞停止跳动，肌球蛋白表达被抑制至10％以下。但是，GATA-4和MEF2C的表达水平保持不变。从上面可以看出，MAPK级联对于心肌细胞分化很重要。尽管MAPK级联对于CSX的启动子活性很重要，但它对GATA-4和MEF2C的表达没有影响，这表明MAPK Cascade可能参与组织特异性转录因子水平的心肌分化。