酵母を用いた低コストタンパク質生産システムの構築

利用酵母构建低成本蛋白质生产系统

• 批准号: 08760075
• 负责人: 西村 克史
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: University of Yamanashi
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08760075/
• 关键词: 酵母; タンパク質生産; エリスリトール; 脱水素酵素

1)誘導発現プロモーターの検索エリスリトール分解素活性が、NAD依存性であると仮定し、エリスリトールを基質、NADを補酵素とし活性染色を試みた。その結果、基質を加えたものにのみ一本の活性バンドが確認され、エリスリトール分解活性をもつ酵素はNAD依存性脱水素酵素であると考えられた。Lipomyces starkeyiをエリスリトールを炭素源として生育させた場合に見られた本酵素活性は、グルコースを炭素源とした場合には見られず、この活性はエリスリトールを資化する場合に誘導発現されることが分かった。従って、本酵素遺伝子の上流には、誘導発現プロモーターが存在すると考えられる。2)エリスリトール脱水素酵素の精製と性質L.starkeyiの粗酵素抽出液より、硫安分画、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーを用いほぼ均一になるまで精製した。分子量はSDS-PAGEより約3万、ゲル濾過より約12万と見積もられ、本酵素はサブユニット分子量約3万の4量体であると推定された。酸化反応の基質特異性を調べた結果、グリセロールは、エリスリトールに対して約60%の反応性を示したが、その他の3糖、4糖、5糖、6糖は基質にならず、本酵素の基質特異性はかなり高いものであることが分かった。酸化反応のpH依存性を検討したところ、最適pHは10.5付近に存在することが分かった。また、エリスリトールとNADの見かけのKm値を測定した結果、エリスリトールに対しては約28mM、NADに対しては約0.14mMとなった。またこの段階の精製酵素の比活性は10U/mgであり、turn over数は5.6/sであった。本酵素をSDS-PAGEに供し、その後PVDF膜へブロッティングを行い、本酵素バンドを切り出しN末端のアミノ酸シーケンスを行った結果、21残基が明らかになった。

1) induced 発 now プ ロ モ ー タ ー の 検 cable エ リ ス リ ト ー ル decomposition activity が, NAD dependency で あ る と 仮 し, エ リ ス リ ト ー ル を substrates, NAD を repair enzyme と し reactive dyeing を try み た. そ の result, matrix を え た も の に の み a の active バ ン ド が confirm さ れ, エ リ ス リ ト ー ル decomposition activity を も つ enzyme は NAD dependency dehydrated vegetable enzyme で あ る と exam え ら れ た. Lipomyces starkeyi を エ リ ス リ ト ー ル を carbon source と し て fertility さ せ た occasions に see ら れ た this enzyme activity は, グ ル コ ー ス を carbon source と し た occasions に は see ら れ ず, こ の active は エ リ ス リ ト ー ル を endowment the す る occasions に induced 発 now さ れ る こ と が points か っ た. Youdaoplaceholder0, the residual 伝 of this enzyme flows in the に に, and the induced occurrence of プロモ プロモ タ タ が が is found in すると. 2) エ リ ス リ ト ー ル nature of dehydrated vegetable enzyme の refined と L.s tarkeyi の crude enzyme extract よ り, sulfur content, ゲ filtration ク ル ロ マ ト グ ラ フ ィ ー, イ オ ン exchange ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を with い ほ ぼ uniform に な る ま で refined し た. About 30000, molecular weight は sds-page よ り ゲ ル filtration よ り about 120000 と see product も ら れ, this enzyme は サ ブ ユ ニ ッ ト molecular weight about 30000 の 4 quantity body で あ る と presumption さ れ た. Acidification anti 応 の substrate specificity を adjustable べ た results, グ リ セ ロ ー ル は, エ リ ス リ ト ー ル に し seaborne て about 60% の anti 応 を shown し た が, そ の he の 3, 4, 5, 6, sugar sugar sugar sugar は matrix に な ら ず, this enzyme の substrate specificity は か な り high い も の で あ る こ と が points か っ た. Acidification reacts to 応 <s:1> pH dependence を検 to <s:1> たと ろ ろ, and the optimal pH 10.5 is close to に. There are する とが とが points of った. ま た, エ リ ス リ ト ー ル と NAD の see か け の Km numerical determination of を し た results, エ リ ス リ ト ー ル に し seaborne て は about 28 mM, NAD に し seaborne て は is about 0.14 mM と な っ た. Youdaoplaceholder0 <s:1> the specific activity of the refined enzyme <s:1> of the <s:1> stage <s:1> is であ 10U/mgであ, and the turn over number is <s:1> 5.6/sであった. This enzyme を sds-page に for し, そ の PVDF membrane after へ ブ ロ ッ テ ィ ン グ を い, this enzyme バ ン ド を り cutting out し N terminal の ア ミ ノ acid シ ー ケ ン ス を line っ た results, 21 residues が Ming ら か に な っ た.