权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

蛍光共鳴エネルギー転移FRETを用いた2つのタンパク質の相互作用の測定

使用荧光共振能量转移 FRET 测量两种蛋白质的相互作用

基本信息

批准号：
09877431
负责人：
長尾拓
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、βアドレナリン受容体(β受容体)を用いGreen Fluorescent Protein(GFP)の有用性を検討した。野生型のβ2受容体は、アゴニスト刺激により細胞内に移行(インターナライズ)する。GFPをカルボキシ末端に付加させたβ2受容体-GFPもアゴニスト刺激によりインターナライズすることが、共焦点レーザー顕微鏡で観察された。従って、GFPの付加は受容体の性質に影響を与えないと考えられた。これに対し、β受容体サブタイプの一つであるβ1受容体はアゴニスト刺激してもインターナライズしない。GFPを付加させて局在を調べると、アゴニストで刺激してもβ1受容体は細胞表面より動かず、また特定の場所に集合することもなかった。このβ1受容体のインターナリゼーション抵抗性は、リン酸化されたβ1受容体に結合しインターナリゼーションを促進するP-アレスチンとの結合が弱いことに原因があることを示した。酵母の2ハイブリッド法により、β2受容体と相互作用するタンパク質としてCLCP Cl^-チャネルをクローニングした。CLCP Cl^-チャネルにGFPを付加させ細胞に発現させると、主に核に発現し、一部は細胞内小胞と細胞膜にも発現していた。CLCP Cl^-チャネルにGFPとは吸収および蛍光波長の異なるBFPを融合させ、β2受容体-GFPとともに発現させた。しかし、CLCP Cl^-チャネルの細胞膜に発現している割合が低いために、両者の間に蛍光共鳴エネルギー転移は検出できなかった。また、β2受容体はアゴニスト刺激により二量体を形成する。しかし、GFP.BFPを付加させた132受容体の間に相互作用は検出できなかった。これらの結果は、GFPの有用性はマーカー分子賭しての使用に限られ、2つのGFPの間での蛍光共鳴エネルギー転移は分子間の相互作用の検出には適していないことを示している。

The usefulness of Green Fluorescent Protein(GFP) in the use of β-receptors is discussed. Wild-type β2 receptors are stimulated by intracellular migration. GFP is a receptor for β 2, and GFP is a receptor for β2. GFP is a receptor for β 2. In addition, GFP is affected by the nature of the container. The beta receptor is stimulated by the beta receptor. The GFP receptor is activated at a specific site. The β1 receptor is resistant to acidification and binding to the β 1 receptor. The β1 receptor is resistant to acidification and binding to the β 1 receptor. Yeast 2 receptor interaction, CLCP-C receptor interaction CLCP-1 is produced in cells, nuclei, and membranes. CLCP Cl-GFP is a fusion protein that absorbs light at different wavelengths. CLCP Cl^-1 The β2 receptor is stimulated by the β2 receptor. GFP.BFP is added to the 132 receptor interaction. The results show that GFP's usefulness is limited by its molecular use, and that GFP's fluorescence resonance occurs during molecular interactions.