生物発光を利用した受容体インターナリゼーションの解析

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Gタンパク質共役型受容体がアゴニストで刺激されると,細胞内の小胞に移行する.この過程は各種の受容体間のみならず一つの受容体種に属するサブタイプ間でも異なると言われているが,そのメカニズムなどは明らかでない.またある受容体では測定法の違いにより,アゴニスト刺激によって受容体の細胞内小胞への移行が観察されるという報告とされないという報告があり,それぞれの測定法には限界が存在しているのかもしれない.これまで報告されてきた結果の不一致を明らかにするために,受容体に持続的に蛍光を発するタンパク質Green Fluorescence Protein(GFP)を付加し,アゴニスト刺激後の受容体の動きを経時的に追跡することを試みた.GFPのcDNAを入手し,以下に述べるような改変を行ったGFPを受容体のカルボキシ末端にフレームを合わせ付加させた.受容体は異なる測定法より細胞内小胞への移行に違いが報告されているα_2-アドレナリン受容体を用いた,GFPの受容体への付加は受容体とGFPにオーバーラップするオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR(Polymerase Chain Reaction)法により行った.GFPはアデニンやチミンに富む配列を含むため,通常のPCRの条件ではうまくいかなかった.またGFPの蛍光は65番目のセリンをスレオニンに変えると増大すること,さらに64番目のフェニルアラニンをロイシンに変えると37℃でも蛍光は強く発することが報告されたので,それぞれのアミノ酸を変えた改変GFPを作製した.作製した改変GFPを付加されたα_2-アドレナリン受容体を最終的に哺乳動物の発現ベクターに組み込んだ.今後,細胞に発現させアゴニスト刺激後の受容体の動きを共振点レーザー顕微鏡で追跡する予定である.