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タンパク質機能解明を指向した新規タンパク質選択的ラベル化法の開拓

开发一种新型蛋白质选择性标记方法，旨在阐明蛋白质功能

基本信息

批准号：
13J07086
负责人：
傳田将也
金额：
$ 1.73万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、プロテオーム中での機能未知タンパク質 (標的タンパク質) 選択的ラベル化を可能とするラベル化試薬 SEAlide-based labeling tag (SEAL-tag) の開発を目的としている。昨年度は、標的モデルタンパク質human carbonic anhydrase 1 (hCA1) のSEAL-tagによるラベル化およびラベル化されるアミノ酸残基の同定に取り組み、137番目のLys選択的にラベル化が進行することを明らかとした。さらに、赤血球細胞内のhCAのラベル化にも取り組み、ラベル化効率に課題を残すもののhCA選択的ラベル化を達成した。これらの結果を受け本年度は、生細胞内での標的タンパク質のラベル化に取り組むこととした。標的タンパク質として、FKBP12を選択し、A549細胞内でのラベル化を計画した。第一段階として、FKBP12の合成リガンドであるSLFの合成に取り組んだ。DL-Pipecolinic acidを出発原料として、光学分割を含む数工程を経て、SLFの合成を行った。続いて、SLFをリジン側鎖アミノ基へ導入後、Fmoc固相合成法により、SLFをリガンドとして有するSEAL-tagの合成を達成した。合成したSEAL-tagを用いて、A549細胞ライセート中のFKBP12のラベル化を行ったところ、選択的なラベル化を確認した。続いて、A549細胞中のFKBP12選択的ラベル化に取り組んだが、細胞内でのラベル化は観察されなかった。SLFの大量合成が煩雑な事から、再度標的タンパク質をhCAに変更し、細胞内でのラベル化に取り組む事とした。MCF7細胞中にhCAが発現することが過去に報告されていることから、MCF7細胞を用いることとした。MCF7細胞培養後、SEAL-tagとインキュベートし、hCAのラベル化をSDS-PAGEで確認した。その結果、細胞内タンパク質であるhCA2のラベル化は観察されなかったものの細胞膜構成タンパク質であるhCA12のラベル化を確認した。これら研究結果をもとに、現在論文投稿の準備中である。

In this study, it is possible that the SEAlide-based labeling tag (SEAL-tag) that is selected by the mechanism in this study may be used for the purpose of health care. Last year, human carbonic anhydrase 1 (hCA1) SEAL-tag was used to determine whether the acid residues were the same as those selected by Lys. The hCA cells of red blood cells and red blood cells were isolated from the tissue and the cells of the hCA were selected for the first time. The results of this year's study were affected by the results of this year's study. The results of this year's study are affected by the results of this year's study. Please select FKBP12, A549, and A549 intracellular computers to modify the program. In the first section, the FKBP12 synthesizes the components of the SLF. DL-Pipecolinic acid is used to produce raw materials, optical segmentation includes digital engineering, and SLF synthesis. After the introduction of Fmoc solid-phase synthesis, SLF synthesis, SLF synthesis and SEAL-tag synthesis, the synthesis process was successfully carried out. Synthesize the SEAL-tag to use the key, the A549 cell to change the FKBP12, and the selected confirmation to confirm the error. The cells selected by FKBP12 in A549 cells are sensitive to DNA, and intracellular enzymes in cells are sensitive to microorganisms. A large number of SLF products are synthesized, hCA cells are changed again, and intracellular proteins are detected. In the MCF7 cell, you can see that in the past, you have reported that you have not received any information, and that you have used the MCF7 report in your cell. After MCF7 cell culture, SEAL-tag cell culture, SDS-PAGE cell culture, cell culture and cell culture. The results of this study showed that the membrane of the cell was isolated from the cell membrane and confirmed that the cell membrane was isolated from the cell membrane of the cell. The results showed that the cell membrane was confirmed by hCA2 and hCA12. The results of the study are very good, and we are now preparing for the submission of the article.