モジュール構造対応ペプチドの発現ならびに構造と機能

1.モジュールあるいはその複合体に対応する遺伝子断片の発現をリンカー等由来の外来性アミノ酸配列を含まずに直接発現できるベクターを二種類開発した('ATG-TAG直接発現ベクター';pHT6ならびにpHT8)。pHT6ではATGGATCC部位でのBamHI切断そしてS1処理により,一方pHT8ではCCATGG部位でのNcoI切断そしてDNAポリメラーゼによる修復反応によりATG開始コドンを,また両者ともGACTTAGTC部位でのTth111-I切断そして修復反応によりTAG停止コドンを,ベクターの両末端に位置させ,それにはさまれるように挿入された遺伝子部分からの蛋白断片の発現を可能とするものである。2.予めその中のDraI部位(TTTAAA)を除去した約540塩基対長のリゾチームCDNAの5',3'両端に夫々,XhoI,PstI部位を付加し,一部のDraI部位をのみ残したpBR322に挿入したプラスミドbHT20を作製した。これは成熟型リゾチームN末端のリジンのユドンAAAの直前まで遺伝子を削るのに好都合に設計されており,Bal31消化後,上流のDraI部位での切断,分子内再結合による新しいDraI部位の出現によって選択ができる。現在までの所,目的のクローンは得られていないが,それが得られたら,モジュール【I】〜【V】の複合体ならびにSacI切断によりモジュール【I】〜【III】の複合体(酵素活性コア部分)を得る予定である。3.蛋白質データベースを用いたアミノ酸配列局所相同性解析により,モジュール【II】〜【III】複合体が,N,O-ジアセチルムラミダーゼならびにバクテリオファージ・ラムダのエンドライシンと(どちらも酵素作用がリゾチームに類似),モジュール【III】がプラスミノーゲン等のクリングル構造(システインを含む)と,モジュール【V】がIgK鎖V領域とホモロジーをもつことが示され,モジュールごとに独立の素構造と素機能を持つことが示唆された。

1.モジュールあるいはその複合体に対応する遺伝子断片の発現をリンカー等由来の外来性アミノ酸配列を含まずに直接発現できるベクターを二種類開発した('ATG-TAG直接発現ベクター';pHT6ならびにpHT8)。pHT6ではATGGATCC部位でのBamHI切断そしてS1処理により,一方pHT8ではCCATGG部位でのNcoI切断そしてDNAポリメラーゼによる修復反応によりATG開始コドンを,また両者ともGACTTAGTC部位でのTth111-I切断そして修復反応によりTAG停止コドンを,ベクターの両末端に位置させ,それにはさまれるように挿入された遺伝子部分からの蛋白断片の発現を可能とするものである。2.予めその中のDraI部位(TTTAAA)を除去した約540塩基対長のリゾチームCDNAの5',3'両端に夫々,XhoI,PstI部位を付加し,一部のDraI部位をのみ残したpBR322に挿入したプラスミドbHT20を作製した。これは成熟型リゾチームN末端のリジンのユドンAAAの直前まで遺伝子を削るのに好都合に設計されており,Bal31消化後,上流のDraI部位での切断,分子内再結合による新しいDraI部位の出現によって選択ができる。現在までの所,目的のクローンは得られていないが,それが得られたら,モジュール【I】〜【V】の複合体ならびにSacI切断によりモジュール【I】〜【III】の複合体(酵素活性コア部分)を得る予定である。3.蛋白質データベースを用いたアミノ酸配列局所相同性解析により,モジュール【II】〜【III】複合体が,N,O-ジアセチルムラミダーゼならびにバクテリオファージ・ラムダのエンドライシンと(どちらも酵素作用がリゾチームに類似),モジュール【III】がプラスミノーゲン等のクリングル構造(システインを含む)と,モジュール【V】がIgK鎖V領域とホモロジーをもつことが示され,モジュールごとに独立の素構造と素機能を持つことが示唆された。