プロテインキナーゼC-C2ドメインの高次構造・機能解析

蛋白激酶C-C2结构域的高阶结构和功能分析

• 批准号: 06276212
• 负责人: 橘 秀樹
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06276212/
• 关键词: PKC; カルシウム

昆虫細胞の大量培養およびC2ドメインの産生に際しての、組換えウイルスの最適の感染多重率、発現の経時変化を調べた。蛋白精製に関しては、当初用いていたDEAE celluloseとmonoQの2段のクロマトでは精製度が十分でなく、これらの間にゲル濾過のステップを入れた。これにより1リットルの培養液あたり少なくとも5mgの精製C2ドメイン蛋白が得られるようになった。SDSPAGEや分析用ゲル濾過におけるその移動度は単量体の予想と矛盾しない。また、それは抗C2抗体と選択的に反応した。N-末端の分析はまだである。C2ドメインの遠紫外部CDスペクトルには215nmに負のバンドが見られ、また230-245nmに特徴的な浅い負のバンドが見られた。βシート含量が40%程度と比較的多いと予測される。カルシウム存在下ではこの215nmのバンドの強度が減少した。ホスファチジルセリン存在下では、この減少はカルシウム濃度100μM以下で完了した。ホスファチジルセリン非存在下では、この減少はより高濃度側、具体的にはカルシウム濃度50-1000μMの領域で起こった。すなわちこの脂質は単独のC2ドメインに対してもそのカルシウム結合を助長する。一方、C2ドメインの蛍光スペクトルはカルシウム存在下では強度が1割ちかく増し、蛍光極大波長は青色側に移動した。これはカルシウム結合にともなう蛋白中トリプトファン残基の環境変化を示す。蛍光のこれらの変化は、ホスファチジルセリン非存在下ではやはりカルシウム濃度50-1000μMの領域で起こった。C2ドメイン-カルシウム複合体の、複合体形成反応に関して平衡な、あるいは非平衡なゲル濾過を行い、その分画についてカルシウム原子吸光法を適用した。結合のストイキオメトリの正確な決定はまだであるがおよそ10:1程度の値が得られている。高濃度の1価陽イオンやマグネシウムの影響はなかった。

Large-scale culture of insect cells, C2 sterilization, production, group replacement, optimum infection multiplicity rate, and timely modification of insect cells. Protein refining is done by using DEAE. CelluloseとmonoQの2sectionsのクロマトでは精品が十でなく、これらの间にゲル Filteredのステップを入れた.これにより1 リットルのculture medium あたり小なくとも5mgのRefined C2 ドメインprotein られるようになった. SDSPAGE analysis uses ゲル filtering to filter the degree of movement, the degree of movement, the measurement of the body, and the contradictions.また, それはanti-C2 antibody とselected にanti-C2した. N-terminal analysis method. C2 ドメインのFar ultraviolet external CD スペクトルには 215nm negative のバンドが见られ、また230-245nmに特徴's な shallow いnegative のバンドが见られた. The content of β-tetrafluoroethylene is around 40%, which is relatively high and is expected to be high. In the presence of カルシウム, the intensity of 215nm のバンドの is reduced. In the presence of ホスファチジルセリン, the concentration of はカルシウム is reduced to 100 μM or less, and the results are completed. In the absence of ホスファチジルセリン, the では and このreduce the はより high concentration side, specifically the にはカルシウム concentration is 50-1000μM in the field.すなわちこのlipidは単多のC2ドメインに対してもそのカルシウムcombinationをfuelledする. On the one hand, the intensity of C2 ドメインの蛍光スペクトルはカルシウム exists, and the maximum wavelength of the light is moved to the cyan side. This is a demonstration of the environmental change of the これはカシウム binding にともなう protein in the トリプトファン residue.荍光のこれらの変化は、ホスファチジルセリン不做下ではThe concentration of やはりカルシウム is 50-1000μM in the field. C2 ドメイン-カルシウム complex, complex formation reaction 応に关してbalanceな, あるいはNon-equilibrium filtration and filtration are applicable to atomic absorption spectroscopy. Combined with のストイキオメトリのcorrect なdetermination はまだであるがおよそ10:1 degree の値が got られている. High concentration of の1価阳イオンやマグネシウムのeffect はなかった.