遺伝子組換え菌によるヒト・インターフェロン-βの生産に関する培養工業的研究

利用转基因细菌生产人干扰素-β的工业化培养研究

• 批准号: 63550704
• 负责人: 太田口 和久
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63550704/
• 关键词: インターフェロンβ; 遺伝子組換え菌; 培養工学; 二価金属イオン; プラスミドpSY2501; 生産性; 回分培養; Zn^<2+>

本研究では、ヒト線維芽細胞が生産するインターフェロン-β(以下ヒトIFN-βと表記)遺伝子をクローン化したプラスミドpSY2501(ATCCライブラリー)を有する大腸菌MM294-1株を供試菌し、倍地組成を種々変えてこれ回分培養し、ヒトIFN-βを効率良く生産させるための工学的指針を得ることを目的とした。実験は、37℃下、培養液量300mlで行なった。回分培養実験では、この液量の培養を幾つか並行させて行い、ヒトIFN-βの生産量の経時変化も求めた。ヒトIFN-βは、培養液から集菌した細胞を超音波処理し、2-ブタノール抽出の後に氷酢酸を用いて白濁化を進め、ペレットとして分離した。この分画は、SDSポリアクリルアミド電気泳動およびセファクリルSOOを用いたゲルクロマトグラフィ(カラム長:90cm、流量0.2ml)によってマーカーの蛋白質と対比させ、分子量18000を有することからIFN-βと同定した。また、この分離法によってIFN-β以外の蛋白を極めて効率良く除けることも分った。合成倍地を用いた回分培養では、対数増殖が終了する頃にIFN-βの濃度が最大(3.6×10^<-2>g/l、Lowry法)となるが、その後16nでこの値は、25%程低下することも分った。次に、合成倍地中のZn^<2+>の濃度を0.046mMから0.6nMへと増加させ、回分培養を行なった。その結果、基本倍地で見られたIFN-βの減少を抑制することが出来、IFN-βの収量は約1.8倍程向上した。複合倍地(Y.T倍地)を用いた実験では、菌体の比増殖速度を2倍、IFN-βの生産量を1.4倍程高めることが出来た。然るに集菌した細胞量当りのIFN-βの生産量は1.2倍向上した程度であった。基本倍地のMg^<2+>を3〜100mM、Mn^<2+>を0.04〜1mMと変えた実験では濃度が低い程IFN-βの生産量が高いことが分った。EDTAを添加する実験も行なったが、濃度向上に伴なってIFN-β生産量が増すことが分った。

This study で は, ヒ ト が production line d bud cells す る イ ン タ ー フ ェ ロ ン - beta (the following ヒ ト IFN - beta sign と submission) posthumous son 伝 を ク ロ ー ン change し た プ ラ ス ミ ド pSY2501 (ATCC ラ イ ブ ラ リ ー) を have す る coliform bacteria strains were を MM294-1 し, times form を 々 - え て こ れ back to cultivate し, ヒ ト the IF N-βを efficiency of く production させるため engineering pointer を る とを とを とを purpose と た た Laboratory: で, 37℃, 300ml of culture medium: で lines: なった. The experiment of backdivision culture で で, the volume of <s:1> liquid <s:1> culture を, the number of を を ヒト, the parallel させて row of で, and the time variation of the production volume of ヒトIFN-β <s:1> めた. ヒ ト IFN - beta は, culture か ら set bacteria し た cells を ultrasound 処 し, 2 - ブ タ ノ ー ル after extraction の に 氷 を boggy acid with い て gonorrhea を into め, ペ レ ッ ト と し て separation し た. こ の painting は, SDS ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド electric 気 swimming お よ び セ フ ァ ク リ ル SOO を with い た ゲ ル ク ロ マ ト グ ラ フ ィ (カ ラ ム length: 90 cm, the flow rate of 0.2 ml) に よ っ て マ ー カ ー の protein と than さ seaborne せ, molecular weight of 18000 を す る こ と か ら IFN - beta と be し た. Youdaoplaceholder0 and <s:1> <s:1> separation method によってIFN-β other than <s:1> protein を is extremely めて effective く except for ける, <s:1>, と and った. Composite in を い た points back training で は, moral rights colonization が end す る recollected に IFN - beta の concentration が maximum (3.6 * 10 ^ < - > 2 g/l, Lowry method) と な る が, そ の after 16 n で こ の numerical は, the low 25% range す る こ と も points っ た. In に, synthetic times の zinc ^ 2 + > < の concentration を 0.046 mM か ら 0.6 nM へ と raised plus さ せ line, back to cultivate を な っ た. そ の results, basic times to see で ら れ た IFN - decrease beta の the を す る こ と が out, IFN - beta の 収 は about 1.8 times the amount of lift up し た. To compound times (Y.T times) を い た be 験 で は, bacteria の を 2 times than the good breeding speed, IFN - 1.4 times beta の production を cheng high め る こ と が た. However, the amount of るに colonizing the た cells should increase the production of <s:1> IFN-β <s:1> by 1.2 times to the extent of た であった. Basic times to の Mg ^ 2 + > < を 3 ~ 100 mm, Mn ^ 2 + > < を 0.04 ~ 1 mm と - え た be 験 で は low concentration が い IFN - cheng high beta の production が い こ と が points っ た. EDTA を add す る be 験 も line な っ た が and concentration upward に な っ て IFN - beta production が raised す こ と が points っ た.

项目成果

太田口和久、佐藤平吾、小出耕造: J.ofChemicalEngineering(Japan).

Kazuhisa Otaguchi、Heigo Sato、Kozo Koide：J.ofChemicalEngineering（日本）。

太田口和久: ケミカル・エンジニアリング. 33. 36-39 (1988)

太口一久：化学工程。33. 36-39 (1988)