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遺伝子工学を用いたトランスアミナーゼの触媒反応機構の解析

利用基因工程分析转氨酶催化反应机理

基本信息

批准号：
63580131
负责人：
倉光成紀
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Osaka Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AspAT)の触媒反応機構を解析するために、クローニングした大腸菌ApsATの遺伝子の塩基配列を決定し、その結果をもとにししてAspAT量産化プラスミドを作製し、酸素を生成した。まず最初に、野生型AspATのX線結晶解析を2.5A^^○分解能で行って、活性部位に存在するアミノ酸残基を明らかにした。その結果をもとにして、活性部位に存在し、触媒反応過程で重要な電子の移動に関与する可能性のある残基を、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異法で次のように置換した。Lys258→Arg,Ala,Met,Glu,His;Tyr70→Phe:Tyr225→Pbe,Arg,His;Asp222→Glu,Ala,Asn;His143→Arg,Ala,Asn:Arg292→20種類すべてのアミノ酸残基;Arg386→Lys,His.これら変異型酸素のX線結晶解析も順次行っている。野生型および変異型酸素と基質との反応過程をストップトフロー法で解析したところ、酸素反応は、基質との速い結合平衡過程と遅い律速過程の分子内反応とから成る事が明らかになった。重水素化した基質を用いた実験結果から、律速過程は基質のプロトンが引き抜かれる過程である事も明らかになった。この律速過程では、Lys258,Tyr70,Tyr225,Asp222が重要な役割を果している事が明らかになった。しかし、今まで重要だと考えられてきたHis143は、Ala,Asnに置換しても活性にほとんど影響をあたえなかった事から、今までに一次構造が決定されている十種類の生物すべてに保存されているHis143の役割には疑問が残る。速い結合過程には、基質に存在する2つのアルボキシル基と酸素のArg292,Arg386との静電的相互作用が関与しているが、各々の静電的相互作用のうちで、Argと基質のカルボキシル基との水素結合の寄与は5〜6kcal・mol^<-1>、塩結合の寄与では1〜2kcal・mol^<-1>である事が明らかになった。変異酸素のうちで数種類の酸素については、野生型酸素で検出不可能な反応中間体を観測することができたので、これらの同定を進めている。

The analysis of the catalytic reaction mechanism of AspAT and the determination of the nucleotide sequence of AspAT and the production of AspAT in mass production X-ray crystallographic analysis of the initial and wild-type AspAT showed that the active site had no acid residues. As a result, the presence of active sites, catalytic reactions, the possibility of electron mobility, and the use of site-specific methods of substitution Lys258→Arg,Ala,Met,Glu,His;Tyr70→Phe:Tyr225→Pbe,Arg,His;Asp222→Glu,Ala,Asn;His143→Arg,Ala,Asn:Arg292→20 kinds of acid residues;Arg386→Lys,His. Wild type isoform and matrix reaction process analysis, isoform and matrix reaction equilibrium process and matrix reaction process The process of heavy water conversion is very simple. Lys258,Tyr70,Tyr225,Asp222 are important components of this process. His 143, Ala,Asn, substitution, activity, influence, and preservation of ten species of organisms were determined by a structural analysis. The fast binding process is related to the electrostatic interaction between Arg292, Arg386 and Arg292. The electrostatic interaction between Arg292 and Arg386 is related to the electrostatic interaction between Arg292 and Arg386<-1>. The electrostatic interaction between Arg 292 and Arg 386 is related to the electrostatic interaction between Arg 292 and Arg 292<-1>. A wide variety of iso-acids are available, including wild-type acids, but are not available for intermediate detection.