遺伝子工学を用いたトランスアミナーゼの触媒反応機構の解析

利用基因工程分析转氨酶催化反应机理

• 批准号: 63580131
• 负责人: 倉光 成紀
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Osaka Medical College
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1988
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1988 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63580131/
• 关键词: トランスアミナーゼ; アミノ基転移酸素; 遺伝子工学; 酸素工学; 触媒反応機構; 酸素反応速度論; ビタミンB6; アスパラギン酸トランスアミナーゼ

アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AspAT)の触媒反応機構を解析するために、クローニングした大腸菌ApsATの遺伝子の塩基配列を決定し、その結果をもとにししてAspAT量産化プラスミドを作製し、酸素を生成した。まず最初に、野生型AspATのX線結晶解析を2.5A^^○分解能で行って、活性部位に存在するアミノ酸残基を明らかにした。その結果をもとにして、活性部位に存在し、触媒反応過程で重要な電子の移動に関与する可能性のある残基を、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異法で次のように置換した。Lys258→Arg,Ala,Met,Glu,His;Tyr70→Phe:Tyr225→Pbe,Arg,His;Asp222→Glu,Ala,Asn;His143→Arg,Ala,Asn:Arg292→20種類すべてのアミノ酸残基;Arg386→Lys,His.これら変異型酸素のX線結晶解析も順次行っている。野生型および変異型酸素と基質との反応過程をストップトフロー法で解析したところ、酸素反応は、基質との速い結合平衡過程と遅い律速過程の分子内反応とから成る事が明らかになった。重水素化した基質を用いた実験結果から、律速過程は基質のプロトンが引き抜かれる過程である事も明らかになった。この律速過程では、Lys258,Tyr70,Tyr225,Asp222が重要な役割を果している事が明らかになった。しかし、今まで重要だと考えられてきたHis143は、Ala,Asnに置換しても活性にほとんど影響をあたえなかった事から、今までに一次構造が決定されている十種類の生物すべてに保存されているHis143の役割には疑問が残る。速い結合過程には、基質に存在する2つのアルボキシル基と酸素のArg292,Arg386との静電的相互作用が関与しているが、各々の静電的相互作用のうちで、Argと基質のカルボキシル基との水素結合の寄与は5〜6kcal・mol^<-1>、塩結合の寄与では1〜2kcal・mol^<-1>である事が明らかになった。変異酸素のうちで数種類の酸素については、野生型酸素で検出不可能な反応中間体を観測することができたので、これらの同定を進めている。

ア ス パ ラ ギ ン acid ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ (AspAT) の catalyst を 応 authorities parsing す る た め に, ク ロ ー ニ ン グ し た coliform ApsAT の posthumous son 伝 の salt base with を decided し, そ の results を も と に し し て AspAT production change プ ラ ス ミ ド を し, acid change を generated し た. ま ず に initially, wild type AspAT の X-ray crystal parsing を 2.5 A ^ ^ a. line can decompose で っ て, active site に exist す る ア ミ ノ acid residues を Ming ら か に し た. そ の results を も と に し て, active site に exists し, catalytic 応 で important な electronic の mobile に masato and す る possibility の あ る residues を, synthetic オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を with い た site specific - different method で times の よ う に replacement し た. Lys258→Arg,Ala,Met,Glu,His; Tyr70→Phe:Tyr225→Pbe,Arg,His; Asp222→Glu,Ala,Asn; His143→Arg,Ala,Asn:Arg292→20 kinds すべて ア ア ノ acid residues; Arg386→Lys,His. Youdaoplaceholder0 れら variant acid acid <s:1> X-ray crystallization analysis in sequence って る る る. Wild type お よ び と - different acid element matrix と の anti 応 process を ス ト ッ プ ト フ ロ ー method で し た と こ ろ, acid reverse 応 は, matrix と の speed い combined with equilibrium process と 遅 い の molecules within the law speed process 応 と か ら things る が Ming ら か に な っ た. Heavy water element change し を た matrix with い た be 験 results か ら は matrix, law of speed process の プ ロ ト ン が lead き sorting か れ る process で あ る matter も Ming ら か に な っ た. こ の law speed process で は, Lys258 Tyr70, Tyr225, Asp222 が important な "を cut fruit し て い る matter が Ming ら か に な っ た. Important だ し か し, today ま で と exam え ら れ て き た His143 は, Ala, the Asn に replacement し て も active に ほ と ん ど influence を あ た え な か っ た matter か ら, today ま で に a tectonic が decided さ れ て い る ten kinds の biological す べ て に save さ れ て い る His143 cut に の service は doubt が る residue. Speed い process に は, matrix に す る 2 つ の ア ル ボ キ シ ル base と acid element の Arg292, Arg386 と の electrostatic interactions が masato and し て い る が, various 々 の electrostatic interactions の う ち で, Arg と matrix の カ ル ボ キ シ ル base と の water element の send with は 5 ~ 6 kcal · mol ^ < 1 >, salt To で で 1 to 2kcal · mol^<-1>である が Ming ら になった になった. - different acid element の う ち で several kinds の acid element に つ い て は, wild type acid で 検 out impossible な anti 応 intermediates を 観 measuring す る こ と が で き た の で, こ れ ら の with fixed を め て い る.

项目成果

Katsura INOUE.: J.Biochem.104. 778-784 (1988)

Katsura INOUE.：J.Biochem.104。

Sigehiro KAMITORI.: J.Biochem.104. 317-318 (1988)

Sigehiro KAMITORI.：J.Biochem.104。

Yasushi INOUE.: J.Biol Chem.264. (1989)

井上靖。：J.Biol Chem.264。

Hideyuki HAYASHI.: Biochem Biophys.Res Commun.(1989)

Hideyuki HAYASHI.：Biochem Biophys.Res Commun.(1989)

倉光 成紀: 生物物理. 28. 7-11 (1988)

仓光茂德：生物物理学。28. 7-11 (1988)