高度好熱菌遺伝子操作のための薬剤耐性遺伝子の耐熱化

高温细菌基因工程的耐热耐药基因

• 批准号: 11878118
• 负责人: 倉光 成紀
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11878118/
• 关键词: 遺伝子操作; 高度好熱菌; Thermus thermophilus HB8; 薬剤耐性遺伝子; カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ; ランダム変異; カナマイシン; 耐熱化酵素

高度好熱菌Thermus thermophilus HB8は,遺伝子操作系が確立した生物の中で最も高温で棲息可能な生物である。この高度好熱菌とランダム変異法とを利用して,カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Kan)をコードするカナマイシン薬剤耐性遺伝子を85℃まで耐熱化し,これまでで最も耐熱性の薬剤耐性遺伝子を作製することに作製に成功した。得られた耐熱性変異型酵素の中から約100個のクローンを選択して塩基配列を決定し,そらのアミノ酸配列を比較して,置換アミノ残基の中から耐熱化に寄与するいくつかのアミノ酸残基を同定した。耐熱化機構を調べるために,溶液中での蛋白質機能解析や分子動力学的計算を行ったところ,このKanの耐熱化は,分子の柔らかい部分を固くすることで達成されていることが示唆された。この耐熱性遺伝子を利用して,高度好熱菌の遺伝子破壊株を作製する簡便な方法を確立,アミノ酸代謝系やDNA修復系酵素群の遺伝子破壊株を作製した。それによって得られた遺伝子破壊株は,期待通りのアミノ酸代謝欠損やDNA修復能欠損の性質を示した。ここで確立した遺伝子破壊株作製法は,高度好熱菌T.thermophilus HB8の機能ゲノム科学的解析に威力を発揮し,得られた遺伝子破壊株の情報は,蛋白質の系統的立体構造解析(構造ゲノム科学的解析)の情報とともに,機能未知の蛋白質の機能解析に大いに役立つと期待される。

Thermus thermophilus HB8, a highly pathogenic bacterium, has been established as the highest temperature possible for living organisms. This highly thermophilic bacteria was successfully produced by using different methods to produce the most resistant gene at 85℃. About 100 amino acid residues were selected from among the thermostable isoenzymes, and the amino acid residues were compared. The heat resistance mechanism of protein in solution and molecular dynamics calculation were studied. The use of these heat resistant genes, highly resistant bacteria and their gene fragments, and the establishment of a simple method for the production of gene fragments from acid metabolizers and DNA repair enzymes The results showed that the DNA repair function was impaired by acid metabolism. This paper establishes the function of T.thermophilus HB8 and its preparation method. The function of T.thermophilus HB8 needs scientific analysis to develop its power. The information of T. thermophilus HB8 is obtained. The three-dimensional structure analysis of protein system (structure needs scientific analysis) needs information. The function analysis of protein with unknown function is expected.

项目成果

Nakagawa,N.: "Crystal Structure of Thermus thermophilus HB8 UvrB Protein,A Key Enzyme of Nucleotide Excision Repair"J.Biochem.. 126(6). 986-990 (1999)

Nakakawa,N.：“嗜热栖热菌 HB8 UvrB 蛋白的晶体结构，核苷酸切除修复的关键酶”J.Biochem.. 126(6)。

Kato R.: "Effect of ssDNA and Temperature on Activity of Thermu thermophilus RecA Protein"Eur. J. Biochem.. 259・. 592-601 (1999)

加藤 R.：“ssDNA 和温度对嗜热菌 RecA 蛋白活性的影响”Eur. J. Biochem.. 259・601 (1999)

Yokoyama,S.: "Structural Genomics Projects in Japan"Prog.Biophys.Molec.Biol.. 73. 363-376 (2000)

Yokoyama,S.：“日本的结构基因组学计划”Prog.Biophys.Molec.Biol.. 73. 363-376 (2000)

Hoseki,J.: "Directed Evolution of Thermostable Kanamycin-Resistant Gene Products in an Extremely Thermophilic Bacterium, Thermus thermophilus"J.Biochem.. 126・5. 951-956 (1999)

Hoseki, J.：“极端嗜热细菌、嗜热栖热菌中耐热卡那霉素基因产物的定向进化”J.Biochem.. 126・5（1999）。

Sugahara M.: "Crystallization and Preliminary X-ray Crystallography of T. thermophilus MutM Involved in Repairs of Oxidative DNA Damage"J. Biochem.. 127・1. 9-11 (1999)

Sugahara M.：“参与氧化DNA损伤修复的嗜热嗜热菌MutM的结晶和初步X射线晶体学” J. Biochem.. 127・1 (1999)