糸状菌のαーガラクトシダ-ゼcDNAのクロ-ニングと1次構造の推定

丝状真菌α-半乳糖苷酶cDNA的克隆和一级结构的估计

• 批准号: 02660078
• 负责人: 小林 秀行
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02660078/
• 关键词: αーガラクトシダ-ゼ; Penicillium purpurogenum; Mortierella vinacea; 一次構造; 塩基配列; クロ-ニング

Penicillium purpurogenumのαーガラクトシダ-ゼのクロ-ニングの為に、精製酵素のN末端配列を決定した。それを基にオリゴヌクレオチドを合成したが,プロ-ブとして適した配列が見出せず、クロ-ニングに因難を伴う事が予想された。一方,糸状菌Mortierella vinaceaのαーガラクトシダ-ゼのN末端配列を決定したところ,QMGWNTなるオリゴヌクレオチドプロ-ブに適した配列が見出されたので,まずM.vinaceaのαーガラクトシダ-ゼのcDNAクロ-ニングを行い,次いでそのcDNAをプロ-ブとして,P.purpurogenum αーガラクトシダ-ゼとクロ-ニングを行うこととした。まず,M.vinaceaの培養菌体から全RNAを調製し,次いでオリゴ(dT)ーセルロ-スカラムによりmRNA画分を得た。cDNA合成後,λgt10に挿入しインビトロパッケ-ジングし,オリゴヌクレオチドプロ-ブを用してプラ-クハイブリダイゼ-ションを行った。約3万個のプラ-クの中から1個のポジティブクロ-ンが得られた。このcDNAの大きさ(1.2Kbp)は,糖鎖を除去した酵素の分子量4〜4.5万をコ-ドするのに十分な大きさであったので,その塩基配列の決定を試みた。現在までに約50%(600bp)の塩基配列が明らかになっている。その結果、本cDNAはαーガラクトシダ-ゼのN末端配列を含み,5'側に転写開始点と思われるMetに続く疎水性度の高いシグナル配列様の配列が存在した。塩基配列から推定される一次構造をヒト及び酵母のαーガラクトシダ-ゼと比較したところ,N端部分にホモロジ-の高い領域(TPーMGWーW,GーKDーGYY,DDLW)がみられ,これらの領域が活性に関っている事が示唆された。また,3'領域には,AATAAAのポリA付加シグナル及びポリA鎖が存在した。本cDNAがM.vinaceaのαーガラクトシダ-ゼのcDNAである事が明らかとなったので,現在塩基配列の解明及び,P.purpurogenum αーガラクトシダ-ゼcDNAライブラリ-の本cDNAを用いたスクリ-ニングを行っている。

The content of Penicillium purpurogenum α was determined by the N-terminal column of the purified enzyme. I don't know what to do. I don't know. I don't know what to do. On one side, the fungus Mortierella vinacea, alpha, cDNA, and N-terminal were arranged to determine the size of the cDNA, the row, the row P.purpurogenum α, please do not know what to do. The whole RNA cell was cultured in M.vinacea, and the mRNA score was obtained in the next step (dT). After the cDNA is synthesized, the lambda gt10 is inserted into the computer network, which is the first step of the synthesis. About 30,000 customers-one out of every one in the country-has won a low-income tax. The molecular weight of the enzyme is 4 ~ 45000. The molecular weight of the enzyme is 4-45000. The molecular weight of the enzyme is 4-45000. The molecular weight of the enzyme is 4-45000. At present, about 50% (600bp) of the base number is listed clearly. According to the results of the test, this cDNA is equipped with a column at the N-end of this cDNA, and there is an error in the configuration of the column with high water quality at the starting point of 5 'Met. It is presumed that there is a high level of activity in the field (TPGWW, GDDGYY, DDLW), and that the activity of the field is different from that of the yeast in the first place. In the field of payment, 3 'domain, AATAAA payment plus payment and payment, please do not know if there is a problem. This cDNA

项目成果

H.Kobayashi,T.Sato,K.Kasamo,I.Kusakabe and K.Murakami: "Cloning and Sequence Analysis of Fungal αーGalactosidases" Agric.Biol.Ehem.

H.Kobayashi、T.Sato、K.Kasamo、I.Kusakabe 和 K.Murakami：“真菌 α-半乳糖苷酶的克隆和序列分析”Agric.Biol.Ehem。