糸状菌のαーガラクトシダ-ゼcDNAのクロ-ニングと1次構造の推定

丝状真菌α-半乳糖苷酶cDNA的克隆和一级结构的估计

• 批准号: 02660078
• 负责人: 小林 秀行
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02660078/
• 关键词: αーガラクトシダ-ゼ; Penicillium purpurogenum; Mortierella vinacea; 一次構造; 塩基配列; クロ-ニング

Penicillium purpurogenumのαーガラクトシダ-ゼのクロ-ニングの為に、精製酵素のN末端配列を決定した。それを基にオリゴヌクレオチドを合成したが,プロ-ブとして適した配列が見出せず、クロ-ニングに因難を伴う事が予想された。一方,糸状菌Mortierella vinaceaのαーガラクトシダ-ゼのN末端配列を決定したところ,QMGWNTなるオリゴヌクレオチドプロ-ブに適した配列が見出されたので,まずM.vinaceaのαーガラクトシダ-ゼのcDNAクロ-ニングを行い,次いでそのcDNAをプロ-ブとして,P.purpurogenum αーガラクトシダ-ゼとクロ-ニングを行うこととした。まず,M.vinaceaの培養菌体から全RNAを調製し,次いでオリゴ(dT)ーセルロ-スカラムによりmRNA画分を得た。cDNA合成後,λgt10に挿入しインビトロパッケ-ジングし,オリゴヌクレオチドプロ-ブを用してプラ-クハイブリダイゼ-ションを行った。約3万個のプラ-クの中から1個のポジティブクロ-ンが得られた。このcDNAの大きさ(1.2Kbp)は,糖鎖を除去した酵素の分子量4〜4.5万をコ-ドするのに十分な大きさであったので,その塩基配列の決定を試みた。現在までに約50%(600bp)の塩基配列が明らかになっている。その結果、本cDNAはαーガラクトシダ-ゼのN末端配列を含み,5'側に転写開始点と思われるMetに続く疎水性度の高いシグナル配列様の配列が存在した。塩基配列から推定される一次構造をヒト及び酵母のαーガラクトシダ-ゼと比較したところ,N端部分にホモロジ-の高い領域(TPーMGWーW,GーKDーGYY,DDLW)がみられ,これらの領域が活性に関っている事が示唆された。また,3'領域には,AATAAAのポリA付加シグナル及びポリA鎖が存在した。本cDNAがM.vinaceaのαーガラクトシダ-ゼのcDNAである事が明らかとなったので,現在塩基配列の解明及び,P.purpurogenum αーガラクトシダ-ゼcDNAライブラリ-の本cDNAを用いたスクリ-ニングを行っている。

确定纯化酶的N末端序列，用于克隆紫乳脂化α-半乳糖苷酶的克隆。基于此合成​​了寡核苷酸，但未发现合适的序列作为探针，并且可以预期克隆会成为原因。另一方面，当确定丝状真菌莫蒂埃氏菌的α-半乳糖苷酶的N末端序列确定了适用于称为QMGWNT的寡核苷酸探针的序列，因此发现了CDNA，因此首先将cDNA与M. vinacea alpha-galactostase和P. p. p. p.urogentacts一起克隆，然后将其固定在p. 探测。首先，从乙二醇分枝杆菌的培养细胞中制备总RNA，然后通过寡核（DT） - 细胞镜柱获得mRNA级分。 cDNA合成后，将混合物插入λGT10，在体外包装，并使用寡核苷酸探针进行板杂交。从大约30,000张斑块中获得了一个阳性克隆。该cDNA（1.2 kbp）的大小足够大，足以编码已去除糖链的酶的分子量，因此试图确定其碱基序列。迄今为止，已经揭示了大约50％（600 bp）的基础序列。结果，该cDNA包含α-半乳糖苷酶的N末端序列，并且发现Met后高度疏水信号序列样序列（似乎是转录起始点）被发现是5'侧。在N末端发现了从基本序列与人和酵母α-半乳糖苷酶推导的主要结构，高同源区域（TP-MGW-W，G-KD-GYY，DDLW），这表明这些区域参与了活性。此外，在3'区域中存在AATAAA和Polya链的Polya添加信号。已经揭示了该cDNA是vinacea的cDNA，目前正在使用该cDNA阐明基础序列，并使用该cDNA进行筛选。

项目成果

H.Kobayashi,T.Sato,K.Kasamo,I.Kusakabe and K.Murakami: "Cloning and Sequence Analysis of Fungal αーGalactosidases" Agric.Biol.Ehem.

H.Kobayashi、T.Sato、K.Kasamo、I.Kusakabe 和 K.Murakami：“真菌 α-半乳糖苷酶的克隆和序列分析”Agric.Biol.Ehem。