黄色ブドウ球菌のペニシリン結合蛋白(PBP)遺伝子のクロ-ニングの試み

尝试克隆金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白（PBP）基因

• 批准号: 02670186
• 负责人: 平松 啓一
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1990
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1990 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02670186/
• 关键词: ペニシリン結合蛋白; 黄色ブドウ球菌; エレクトロポレ-ション

ペニシリン結合蛋白(PBP)のクロ-ニングを行うため、マ-カ-を付したPBPの作製を行なった。即ち、黄色ブドウ球菌株1039(ペニシリナ-ゼ非産生、レストリクションマイナス)を、アンピシリン(ABPC)を加えた培養液で継代する方法、ニトロソグアニジン処理により突然変異を誘導する方法の二つを用い、ABPC耐性株を作製した。 前者によりABPCの最小阻止濃度(MIC)が0.2μg/mlの1039親株から出発して漸増的に濃度を上げたABPCを含むLーブロスで6回、21日間の培養の後、MIC100の変異株1039AR(100)を得た。後者からは、一段階の耐性選択によりABPC50μg/mlのHI平板に増殖可能の耐性株7株を得た。これら変異株の細胞質膜を抽出し、^<14>CラベルしたペニシリンG(PCG)と30分反応させPBPパタ-ンをSprattのポリアクリラミド電気泳動を用いて解析した。その結果、ひとつの株(AR1)を除く全ての株でPBP2の過剰産生(親株の約5倍)が認められた。 一方、AR1では、PBP2の過剰産生は、ゲルの染色パタ-ンから認められたがPCGとの反応性が弱く、PBP2のペニシリン結合部の突然変異が示唆された。次にAR1から染色体DNAを抽出し、Sau3AI制限酵素で部分消化した。このDNAとBamHI切断したシャトルベクタ-pSC298(pRIT5プラスミドのクロラムフェニコ-ル耐性遺伝子を含む断片をoriとともにpHSG298のClaI部位に結合したもの)とライゲ-トし、エレクトロポレ-ション法を用いて1039株を形質転換し、ABPC10μg/mlを含む平板で選択し、2株の耐性変異株を得た。現在これに2株から得た組換えプラスミドの解析を行なっている。

ペニシリン-binding protein (PBP) のクロ-ニングを行うため, マ-カ-をpaid したPBP を行なった. That is, yellow ブドウ strain 1039 (ペニシリナ-ゼ non-production, レストリクションマイナス)を, アンピシリン(ABPC)をplus The method of using the culture medium, the method of using the culture medium, the method of nurturing the different strains, and the production of ABPC-resistant strains. The former has a minimum inhibitory concentration (MIC) of ABPC of 0.2 μg/ml and the 1039 parent strain has a gradually increasing concentration. After 6 times of ABPC containing L-ブロス and 21 days of culture, the MIC100 strain 1039AR (100) was obtained. For the latter, the first-stage resistance was selected by selecting the ABPC 50 μg/ml HI plate and 7 strains of resistant strains that could be propagated were obtained.これら変isocytoplasmic membrane extractionし、^<14>CラベルしたペニシリンG(PCG)と30のポリアクリラミド电気phoresisを用いてANALYSISした. As a result, the ひとつの strain (AR1) was eliminated and the whole ての strain was produced by crossing the PBP2 strain (about 5 times of the parent strain). One party, AR1では, PBP2のpassing productionは, ゲルの色パタ-ンからcognitionめられたがPCG has a weak reactive nature, and PBP2 has a sudden change in the binding site. The AR1 chromosomal DNA was extracted and the Sau3AI restriction enzyme was partially digested.このDNAとBamHI cut したシャトルベクタ-pSC298(pRIT5プラスミドのクロラムフェニコ-ルresistant 伝子を contain む fragment をoriとともにpHSG298のCla Part I combines したもの) とライゲ-トし, エレクトロポレ-ション法を用いて1039 strainをThe quality was changed, ABPC 10μg/ml was selected from the plate, and 2 strains were selected from different strains with different tolerances. Now the two strains of これにからget the たプラスミドのanalytic を行なっている.