バクテリアのべん毛モータのスイッチコンプレックスの構造解析

べん毛モータのスイッチ・コンプレックスは、回転方向の制御、トルク発生、べん毛モータの構造形成等の複雑な現象に直接関与する多機能構造体で、FliG,FliM,FliNの3種類のタンパク質からなる複合体である。前年度までの知見をもとに、スイッチ・タンパク質の所在を明らかにするのが本年度の研究目標である。精製したタンパク質を用いた試験管内再構成実験において、FliGはMSリング(FliFの集合体)に直接結合することが示された。また、FliMとFliNは結合しやすく、大きな凝集体を作って沈澱した。FliMはMSリングと結合するが、FliNは結合しなかった。その後エール大学のマクナブらによりFliF-FliGの融合タンパク質が正常に働くことが示され、FliGがMSリングに直接強固に結合していることが明らかとなった。我々はMSリングのどの部位にFliGが結合するのかを明らかにするために、融合タンパク質からなるMSリング-FliG複合体のドメイン構造をトリプシン処理により調べた。MSリング自身トリプシンには敏感であるが、融合タンパク質からなる複合体も同様にトリプシンの作用を受けやすく、Sリングとロッド部分を残して他の部分は分解された。分解され残った部分のアミノ酸配列解析から、FliFのN端とFliGを含むC端がそれぞれ100残基余り消化されたことがわかった。さらに、FliFのC端約100残基を欠損した遺伝子を作製し、これからできたMSリングを電子顕微鏡で観察したところ、Mリングの周辺が欠けていた。以上のことから、FliGはMリングの周辺に直接、比較的強固に結合していることが明らかである。FliMは弱く結合し、またFliNはMSリングに直接結合はしないで、FliMを通して結合している。結合部位はまだわからない。

べん毛モータのスイッチ・コンプレックスは、回転方向の制御、トルク発生、べん毛モータの構造形成等の複雑な現象に直接関与する多機能構造体で、FliG,FliM,FliNの3種類のタンパク質からなる複合体である。前年度までの知見をもとに、スイッチ・タンパク質の所在を明らかにするのが本年度の研究目標である。精製したタンパク質を用いた試験管内再構成実験において、FliGはMSリング(FliFの集合体)に直接結合することが示された。また、FliMとFliNは結合しやすく、大きな凝集体を作って沈澱した。FliMはMSリングと結合するが、FliNは結合しなかった。その後エール大学のマクナブらによりFliF-FliGの融合タンパク質が正常に働くことが示され、FliGがMSリングに直接強固に結合していることが明らかとなった。我々はMSリングのどの部位にFliGが結合するのかを明らかにするために、融合タンパク質からなるMSリング-FliG複合体のドメイン構造をトリプシン処理により調べた。MSリング自身トリプシンには敏感であるが、融合タンパク質からなる複合体も同様にトリプシンの作用を受けやすく、Sリングとロッド部分を残して他の部分は分解された。分解され残った部分のアミノ酸配列解析から、FliFのN端とFliGを含むC端がそれぞれ100残基余り消化されたことがわかった。さらに、FliFのC端約100残基を欠損した遺伝子を作製し、これからできたMSリングを電子顕微鏡で観察したところ、Mリングの周辺が欠けていた。以上のことから、FliGはMリングの周辺に直接、比較的強固に結合していることが明らかである。FliMは弱く結合し、またFliNはMSリングに直接結合はしないで、FliMを通して結合している。結合部位はまだわからない。