インターロイキン1受容体の細胞内領域と会合するタンパク質因子の解析

IL-1受体胞内区相关蛋白因子分析

• 批准号: 05770228
• 负责人: 久野 耕嗣
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05770228/
• 关键词: インターロイキン1; 受容体; 会合タンパク; シグナル伝達; プロテインキナーゼ; TNF; インターロイキン8

1) 本研究は、IL-1R/GSTの融合タンパク質を用い、IL-1Rの細胞内領域と特異的に結合するタンパク因子を同定、精製することを目的としている。ます、マウス、タイプI-IL-1RのcDNAをテンプレートとしてPCR法によりIL-1Rの細胞内領域部分のDNAフラグメントを増幅し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク発現ベクターpGENT2に組み込み、pCL1R/GSTプラスミドを得た。次にこのプラスミドを用い、大腸菌JM109株でIPTG刺激によりIL-1R/GST融合タンパク質の発現を行ったところ、期待された50kDaのIL-1R/GST融合タンパク質の大量発現がSDS-PAGE上で観察された。しかし発現されたIL-1R/GST融合タンパク質は、そのほとんどが不溶性分画に存在するため精製が難しく、現在のところSDS-PAGE上単一バンドになるまで精製されていない。現在、グアニジン法による可溶化とHPLC等によるIL-1R/GST融合タンパク質の精製を試みている。また、GST以外の他の融合タンパク発現系を現在検討中である。2) 上記の実験と平行して、IL-1,TNFによるシグナル伝達経路,特にIL-8産生誘導に関与するプロテインキナーゼを検索する基礎的知見を得るため、各種プテインキナーゼ阻害剤の作用を調べた。その結果、胃癌細胞株MKN45細胞でのIL-1,TNFによるIL-8産生誘導および、IL-8遺伝子プロモーターの活性化は、プロテインキナーゼ阻害剤H7により濃度依存的に抑制されるが、HA1004やスタウロスポリンではIL-1,TNFの作用は抑制されないことがわかった。これらの結果から、IL-8遺伝子発現誘導におけるIL-1,TNFによるシグナル伝達にPKCとは異なるH7感受性キナーゼが関与することが示唆された。またIL-1,TNFによるIL-8産生はチロシンキナーゼ阻害剤であるハービマイシンAにより阻害されることから、IL-1,TNFによるIL-8産生誘導のいずれかのステップにチロシンキナーゼが関与していることが示唆された。

1)This study aimed to identify and refine IL-1R/GST fusion proteins and IL-1R intracellular domain specific binding factors. The cDNA sequence of IL-1R was amplified by PCR, and the DNA sequence of IL-1R in the intracellular domain was amplified by PCR. The fusion protein of pCL1R/GST was developed by pGENT2. In addition, Escherichia coli JM109 strain was stimulated with IPTG to produce IL-1R/GST fusion protein, which was expected to produce 50kDa IL-1R/GST fusion protein. The IL-1R/GST fusion protein was purified by SDS-PAGE after purification. Now, the solubilization and HPLC of IL-1R/GST fusion protein were studied. Other fusion technologies besides GST are currently under discussion. 2)In addition, the basic knowledge of IL-1,TNF and IL-8 production and its role in the inhibition of tumor growth was obtained. As a result, gastric cancer cell line MKN45 cells produced IL-1,TNF, IL-8, IL-1,TNF, IL-8, IL-8, IL-1, IL-8, IL-8, IL-8 The results showed that IL-8 gene expression was induced by IL-1,TNF, PKC and H7. IL-1,TNF and IL-8 produce anti-inflammatory drugs. IL-1,TNF and IL-8 produce anti-inflammatory drugs. IL-1,TNF and IL-8 produce anti-inflammatory drugs.

项目成果

Kuno K.: "Structure and function of the intracellular portion of the mouse interleukin 1 receptor(type I)" The Journal of Biological Chemistry. 268. 13510-13518 (1993)

Kuno K.：“小鼠白细胞介素 1 受体（I 型）细胞内部分的结构和功能”生物化学杂志。

Harada A.: "Molecular cloning of cDNA encoding mouse interleukin 8(IL-8)receptor" Gene. (in press). (1994)

Harada A.：“编码小鼠白介素 8(IL-8) 受体 cDNA 的分子克隆”基因。