IL-1非応答性突然変異株の分離とその変異を相補するcDNAのクローニング

分离 IL-1 无反应突变体并克隆补充突变的 cDNA

• 批准号: 07770237
• 负责人: 久野 耕嗣
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770237/
• 关键词: インターロイキン1; シグナル伝達; NFκB; IκB

IL-1非応答性突然変異株の分離とその変異を相補するcDNAのクローニングのプロジェクトについては、研究計画に従って、変異株の分離のための親株となるIL-1応答性安定細胞株を作成中である。今後、目的のIL-1応答性安定細胞株が樹立されしだい、IL-1非応答性突然変異株の分離とIL-8遺伝子活性化に必須に関与するシグナル伝達因子のcDNAのクローニングを試みる予定である。一方、IL-8やIL-6をはじめとする多くのIL-1誘導性遺伝子の発現制御には、転写因子NFκBの活性化が中心的な役割を果たしているが、我々の研究グループでは、上記のプロジェクト以外に、直接NFκBの活性化に関与するシグナル伝達因子の同定を試みている。NFκBは、未刺激の細胞では阻害因子IκBと複合体を形成して不活性型として細胞質に保持されており、IL-1,TNF等による刺激後、IκBαのリン酸化と分解による不活性化の後、NFκBは核へ移行し、標的遺伝子のプロモーターに結合してその転写を促進することが知られている。しかしIκBαを直接リン酸化するプロテインキナーゼはいまだ確立されていない。また最近、JNK(Jun N-terminal kinase)などの重要なシグナル伝達因子は、基質と会合するプロテインキナーゼとして同定されている。そこで我々はGST-IκBα融合タンパクを用い、GST-IκBαとタンパク因子を会合させたのちin vitro kinase reactionを行う系で解析を行った。その結果、ヒト単球系細胞株THP-1の細胞抽出液中にIκBαに特異的に会合してリン酸化する、IκBα会合キナーゼを同定した(Kuno K.et al.,1995)。また種々のGST-IκBαの部分欠損変異体およびアミノ酸置換体を用いた実験の結果から、IκBα会合キナーゼはIκBαのC末端領域の酸性ドメインと相互作用し、同酸性ドメインのSer/Thr残基をリン酸化することが明らかとなった。さらにIκBαのC末端酸性ドメインに対応するペプチドおよびそのアミノ酸置換体を基質としたin vitro kinase reactionの実験から、Ser-293が会合キナーゼによるIκBαにおける主なリン酸化部位であり、Ser-288とThr-291が弱いリン酸化部位であることが明らかとなった。またIκBα会合キナーゼ活性は、THP-1細胞をLPSで刺激した場合、一過性に増強された。我々の研究室では先にTHP-1細胞抽出液を用いたcell-free系でのLPS刺激によるNFκB活性化assayを開発している(Ishikawa Y.et al.,1995)。IκBα会合キナーゼによるリン酸化部位であるIκBαのC末端酸性ドメインのペプチドは、このcell-free系での実験において、LPSによるNFκB活性化を抑制することがわかった。以上の結果からIκBα会合キナーゼによるIκBαのC末端酸性ドメインのリン酸化が、少なくともcell-free系においてはLPS刺激によるNFκB活性化すなわちIκBαの不活性化に重要であることが示唆された。

Isolation of IL-1 non-responsive mutant strains and their variation complement cDNA development and development of IL-1 responsive stable cell lines. In the future, the establishment of IL-1 responsive stable cell lines, isolation of IL-1 nonresponsive mutant strains, and the identification of IL-8 gene activation must be related to the identification of cDNA for IL-1 expression factors. In addition to IL-8 and IL-6, there are many IL-1 inducible gene expression mechanisms that regulate the activation of NF-κ B. NFκB inhibits the formation of IκB complexes in unstimulated cells, inhibits cytoplasmic maintenance, and inhibits activation of IκBα after stimulation by IL-1,TNF, and other factors. NFκB inhibits nuclear migration and promotes binding of target proteins to the cytoplasm. IκBα is directly related to the acid reaction. Recently, JNK(Jun N-terminal kinase) has become an important factor in the development of gene expression and matrix fusion. The GST-I κ Bα fusion factor is used in the analysis of all in vitro kinase reactions. As a result, IκBα-specific conjugation in cell extracts of the single cell line THP-1 was determined (Kuno K.et al., 1995)。The results of the partial depletion of GST-IκBα and the use of acid substitutions show that I κ Bα converges with Ser/Thr residues in the C-terminal domain of IκBα. The C-terminal acidic sites of IκBα are related to Ser-293, Ser-288, Thr-291, and weak acidic sites of IκBα. IκBα binding activity was increased transiently when THP-1 cells were stimulated by LPS. Our laboratory developed the NFκB activation assay for LPS stimulation in THP-1 cell extracts using cell-free systems (Ishikawa Y.et al., 1995)。IκBα syncretism is the site of acidification. The C-terminal acidic site of IκBα is the site of inhibition of NFκB activation in cell-free systems. The above results indicate that the activation of NFκB in response to LPS stimulation is important for the inactivation of I κ B α in a cell-free system.

项目成果

IshikawaY.et al.: "Establishment of LPS-dependent nuclear factor kappa B activation in a cell-free system." J. Biol. Chem.270. 4158-4164 (1995)

IshikawaY.et al.：“在无细胞系统中建立 LPS 依赖性核因子 kappa B 激活。”