大腸菌の産生する遺伝子組換え蛋白(RecA)による遺伝子治療法の開発

利用大肠杆菌产生的重组蛋白（RecA）开发基因治疗

• 批准号: 05857032
• 负责人: 木村 浩一
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Sapporo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05857032/
• 关键词: 遺伝子治療; RecA; gene targeting

遺伝子組み替えに関与するRecA(大腸菌由来)と、強い核指向性を持つSV40 large T antigenのnuclear location signalを融合させた合成酵素(RecA-T)の構造遺伝子を作製した。この融合構造遺伝子を導入したRecA(-)大腸菌は、導入前に比し、紫外線への抵抗力が増加していることが確かめられた。したがって、RecA-Tが、本来の活性を保持しているものと考えられたので、この合成酵素の大量生成を試みた。今回、RecA-T遺伝子の構築に使用したベクターpMAL-c2は、マルトース結合蛋白をコードしており、RecA-Tの構造遺伝子を、マルトース結合蛋白構造遺伝子の直下に挿入し、両者の融合蛋白が産生されるようにした。1lの培養液から、大腸菌を回収し、超音波処理後、細胞残渣を遠心除去し、上清をアミロースレジンで精製して、約20mgの融合蛋白を得た。この融合蛋白をFactor Xaで処理し、マルトース結合蛋白と、RecA-Tに分解した。こうして得られたRecA-Tの、一本鎖DNA結合能とDNA鎖交換能を検討するため、n-H-ras遺伝子の第一エクソンをPCRで増幅し(この際、片方のプライマーをリン酸化しておく)この一部をlambdaエクソヌクレアーゼで処理して、一本鎖DNAを作製した。まず、精製RecA-Tを、一本鎖DNA溶液中に加え、一定時間のインキュベート後、gammaS-ATPを添加して一本鎖-RecA-T結合物を安定化した。続いてlambdaエクソヌクレアーゼ処理をしていないPCR産物(一本鎖DNAと相同な二本鎖DNAということになる)を加え、さらにインキュベートした。この反応物を、PCR産物と共にアガロースゲル電気泳動し、泳動度の差を観察した。この結果、得られたRecA-Tの活性が非常に低いことが判明した。この原因として、大腸菌を破壊する際に用いた界面活性剤、あるいはFactor Xaによる長時間のインキュベートなどによって、RecA-Tが不活化された可能性が考えられた。現在、使用する界面活性剤の検討(不使用を含む)、低温でのFactor Xa処理、あるいは、Factor Xaを使用する必要が無いベクターの検討などを同時に進行させている。

The sub-group of RecA-T was fused with RecA (origin of mycelia) and strong nuclear directivity (SV40 large T antigen). The synthetic enzyme (RecA-T) was used to make spores. The fusion system is used to make sure that the RecA (-) bacteria, the pre-entry ratio, the UV line resistance ratio and the UV resistance ratio are added to each other. The production of a large number of synthetic enzymes, such as enzyme, RecA-T, enzyme, enzyme and enzyme. This time, the RecA-T fusion protein was used to make the fusion protein directly. This time, the fusion protein was used to make the fusion protein. This time, the fusion protein was used to make the fusion protein. This time, the fusion protein was used to make the fusion protein. This time, the fusion protein was used to make the fusion protein, and the fusion protein was used to make the fusion protein. 1l culture solution, mycelium, ultrasound, cell residue, heart removal, supernatant, 20mg fusion protein. The fusion protein, Factor Xa binding protein, and RecA-T binding protein were isolated and analyzed. You can learn from the RecA-T, a DNA combination, the first n-H-ras, the first PCR, the lambda, the lambda, the acidification, and the DNA. After a certain amount of time after the addition of a book of RecA-T, a book of DNA solution and a certain amount of time, a book of salt-RecA-T combination was added to gammaS-ATP to stabilize the drug. This is the same as that of an ordinary university. Lambda is the same as that of an ordinary university. This is the same as that of an ordinary university. This is the same as that of an ordinary university. This is the same as that of an ordinary university. It is the same as that of DNA. The reverse substances and PCR products are used to monitor the swimming activity and the degree of swimming. The results showed that the RecA-T activity was very low. The reason for testing, the activation of the interface for the disruption of bacteria, the detection of Factor Xa for a long time, and the possibility of inactivation of RecA-T for a long time. At present, the use of temperature interface activity monitoring (without the use of halves), low-temperature Factor Xa testing, temperature monitoring, and Factor Xa testing are necessary to do so at the same time.