モデル前駆体蛋白質を用いた小胞体膜透過の分子機構の解明

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細胞内で合成される蛋白質の多くは、リボソーム上での合成にともない、膜透過システムを経て、細胞外に分泌されたり、あるいは細胞内のオルガネラへ局在化する。一般に、分泌型蛋白質の膜透過は原核細胞では細胞膜系、動物細胞では小胞体(ER)膜系をとおして行われ、両者は基本的に同じ機構で膜透過すると考えられている。そこで今年度は、当研究室の大腸菌での膜透過機構の成果をもとに、動物細胞小胞体膜透過の分子機構を解明するために以下の研究を行った。1)大腸菌モデル前駆体蛋白質を用いた膜透過実験を行うにあたり、コムギ胚芽抽出液(WG)によるin vitro蛋白質合成系を見直し、合成の最適条件を決定した。また、膜(イヌ膵臓ミクロソーム画分)透過の律速になるSRP(シグナル認識粒子)を完全精製した。これらを用いて、初めにプレプロラクチンの効率の良い透過システムを確立した。2)この透過システムを用い、大腸菌モデル前駆体蛋白質proOmpF-Lpp,proOmpA及びproOmpA-D26について調べたところ、proOmpAは効率よく膜透過したがその他はプロテアーゼ耐性が見られず、膜透過しなかった。proOmpF-Lpp,proOmpA-D26は、約80アミノ酸残基から成るためSRPに認識される前にリボソームから遊離してしまい、膜にターゲティングできなかったと思われる。今年度はSRPなどの準備、精製に多大な時間がかかってしまい当初の目的に沿った研究成果はあまり得られなかった。現在、前駆体蛋白質の長さを考慮し、proOmpFのpro部分をプロラクチンのN末端につないだキメラ蛋白質(191アミノ酸残基)を作製し膜透過を調べている。