LAPosomeの形成と成熟化の分子機構を明らかにする

LC3-associated phagocytosis (LAP)において、LC3が局在するLAPosomeは、内部の成熟反応が亢進するがその機構は不明な点が多い。これまでに樹立したLAP関連因子MORN2を過剰発現するLAPosome形成効率の高いマクロファージ（MΦ-MORN2）株を用いて、本研究ではSNARE蛋白質SNAP-23に着目し、MORN2やLC3との関連を解析し「LAPosomeの形成と成熟化の分子機構」を明らかにすることを目的とした。令和4年度は、昨年度に引き続き計画②「MORN2とSNAP-23の機能的相互作用の解明」および計画③「LC3とSNAP-23の機能的相互作用の解明」を行った。細胞の状態が悪くなったため、新たにGFP-MORN2とMyc-ALFA-SNAP23を共発現するMΦ株を樹立した。SNAP23は野生型、リン酸化型、非リン酸化型それぞれを発現させた。その結果、SNAP23のリン酸化状態はLAPosome形成効率に影響しなかった。つまり、LC3のphagosome局在化後にSNAP23のリン酸が起こる可能性が考えられた。また、これらの細胞を用いた免疫沈降では、MORN2とLC3についてSNAP23との相互作用は検出できなかった。現在、LC3の膜局在を誘導しSNAP23との相互作用も報告されているAtg16L1について、phagosome膜上でのSNAP23とLC3との共局在のタイミングと相互作用について検証を進めている。さらに、MORN2と相互作用する因子の網羅的解析を行った。mVenus-ALFAとmVenus-ALFA-MORN2をそれぞれ安定発現するMΦ株を樹立し、anti-ALFA nanobodyを用いて免疫沈降した。それぞれの細胞は、zymosanの有無でphagocytosisを誘導した後に回収し、その抽出液を免疫沈降に用いた。免疫沈降物について、研究協力者の福島県立医大・和田教授に質量分析を依頼した。その結果、MORN2と相互作用する因子としてPI4Kα (phosphatidylinositol 4-kinase α)を見出した。現在、クローニングしたPI4KαとMORN2をHEK293T細胞に一過的に発現させ、相互作用を解析している。

LC3-associated phagocytosis (LAP)において、LC3が局在するLAPosomeは、内部の成熟反応が亢進するがその機構は不明な点が多い。これまでに樹立したLAP関連因子MORN2を過剰発現するLAPosome形成効率の高いマクロファージ（MΦ-MORN2）株を用いて、本研究ではSNARE蛋白質SNAP-23に着目し、MORN2やLC3との関連を解析し「LAPosomeの形成と成熟化の分子機構」を明らかにすることを目的とした。令和4年度は、昨年度に引き続き計画②「MORN2とSNAP-23の機能的相互作用の解明」および計画③「LC3とSNAP-23の機能的相互作用の解明」を行った。細胞の状態が悪くなったため、新たにGFP-MORN2とMyc-ALFA-SNAP23を共発現するMΦ株を樹立した。SNAP23は野生型、リン酸化型、非リン酸化型それぞれを発現させた。その結果、SNAP23のリン酸化状態はLAPosome形成効率に影響しなかった。つまり、LC3のphagosome局在化後にSNAP23のリン酸が起こる可能性が考えられた。また、これらの細胞を用いた免疫沈降では、MORN2とLC3についてSNAP23との相互作用は検出できなかった。現在、LC3の膜局在を誘導しSNAP23との相互作用も報告されているAtg16L1について、phagosome膜上でのSNAP23とLC3との共局在のタイミングと相互作用について検証を進めている。さらに、MORN2と相互作用する因子の網羅的解析を行った。mVenus-ALFAとmVenus-ALFA-MORN2をそれぞれ安定発現するMΦ株を樹立し、anti-ALFA nanobodyを用いて免疫沈降した。それぞれの細胞は、zymosanの有無でphagocytosisを誘導した後に回収し、その抽出液を免疫沈降に用いた。免疫沈降物について、研究協力者の福島県立医大・和田教授に質量分析を依頼した。その結果、MORN2と相互作用する因子としてPI4Kα (phosphatidylinositol 4-kinase α)を見出した。現在、クローニングしたPI4KαとMORN2をHEK293T細胞に一過的に発現させ、相互作用を解析している。