三次元培養肝細胞とその重症肝障害治療への応用

本年度の研究にて達成できたことを、研究計画に記載した順に示す。1:培養条件の設定肝細胞はコラゲナーゼ法によってラットより分離し、環流液の酸素化やその他の工夫によって、約90%程度の細胞生存率を達成できた。培養皿には、0.01%のPVLAをコートすることにより、細胞の強固な接着が得られた。また、培養液に、Epidermal Groth Factorを50μg/dlとInsulinを100nM添加することにより、肝細胞の3次元構造の構築が容易になった。2:細胞増殖と形態変化の観察上記の条件で、肝細胞を1X10^6個/60mmDishで培養開始すると、48時間後にPVLA上で、肝細胞の集合体が多層化し、96時間後に直径約100μmの多層性の肝細胞集合体が形成された。この、spheroid形成の過程で、肝細胞接着蛋白であるコネクチンの変化を観察した。方法は、培養後の経過によって得られたspheroidをアルコール固定し、コネクチン32の抗体を用いた蛍光抗体間接法にて調べた。コネクチンは培養経過とともに徐々に増加し、培養48時間をピークに約一週間にわたって観察された。この変化は、肝細胞doublet cellでは24時間でコネクチンが消失したことと比べると、spheroid cellが肝組織により近い性格を持っていることを示唆するためと考えられた。3:、4:、5:についてはただいま検討中で、まだ有意義な結果が出ていない。また、上記1:、2:の結果は現在投稿中である。

本年度の研究にて達成できたことを、研究計画に記載した順に示す。1:培養条件の設定肝細胞はコラゲナーゼ法によってラットより分離し、環流液の酸素化やその他の工夫によって、約90%程度の細胞生存率を達成できた。培養皿には、0.01%のPVLAをコートすることにより、細胞の強固な接着が得られた。また、培養液に、Epidermal Groth Factorを50μg/dlとInsulinを100nM添加することにより、肝細胞の3次元構造の構築が容易になった。2:細胞増殖と形態変化の観察上記の条件で、肝細胞を1X10^6個/60mmDishで培養開始すると、48時間後にPVLA上で、肝細胞の集合体が多層化し、96時間後に直径約100μmの多層性の肝細胞集合体が形成された。この、spheroid形成の過程で、肝細胞接着蛋白であるコネクチンの変化を観察した。方法は、培養後の経過によって得られたspheroidをアルコール固定し、コネクチン32の抗体を用いた蛍光抗体間接法にて調べた。コネクチンは培養経過とともに徐々に増加し、培養48時間をピークに約一週間にわたって観察された。この変化は、肝細胞doublet cellでは24時間でコネクチンが消失したことと比べると、spheroid cellが肝組織により近い性格を持っていることを示唆するためと考えられた。3:、4:、5:についてはただいま検討中で、まだ有意義な結果が出ていない。また、上記1:、2:の結果は現在投稿中である。