三次元培養肝細胞とその重症肝障害治療への応用

三维培养肝细胞及其在治疗严重肝损伤中的应用

• 批准号: 06770390
• 负责人: 山口 泰
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770390/
• 关键词: 三次元培養肝細胞; コネクチン

本年度の研究にて達成できたことを、研究計画に記載した順に示す。1:培養条件の設定肝細胞はコラゲナーゼ法によってラットより分離し、環流液の酸素化やその他の工夫によって、約90%程度の細胞生存率を達成できた。培養皿には、0.01%のPVLAをコートすることにより、細胞の強固な接着が得られた。また、培養液に、Epidermal Groth Factorを50μg/dlとInsulinを100nM添加することにより、肝細胞の3次元構造の構築が容易になった。2:細胞増殖と形態変化の観察上記の条件で、肝細胞を1X10^6個/60mmDishで培養開始すると、48時間後にPVLA上で、肝細胞の集合体が多層化し、96時間後に直径約100μmの多層性の肝細胞集合体が形成された。この、spheroid形成の過程で、肝細胞接着蛋白であるコネクチンの変化を観察した。方法は、培養後の経過によって得られたspheroidをアルコール固定し、コネクチン32の抗体を用いた蛍光抗体間接法にて調べた。コネクチンは培養経過とともに徐々に増加し、培養48時間をピークに約一週間にわたって観察された。この変化は、肝細胞doublet cellでは24時間でコネクチンが消失したことと比べると、spheroid cellが肝組織により近い性格を持っていることを示唆するためと考えられた。3:、4:、5:についてはただいま検討中で、まだ有意義な結果が出ていない。また、上記1:、2:の結果は現在投稿中である。

This year's research was completed and the research plan was documented. 1: Setting of culture conditions for hepatocytes: isolation, acidification of ocean fluid, and other efforts to achieve a cell survival rate of about 90%. The culture dish contains 0.01% PVLA, and the cells are strong. In addition to 50μg/dl of Epidermal Groth Factor and 100nM of Insulin, it is easy to construct the three-dimensional structure of hepatocytes. 2: Under the conditions noted above, the number of hepatocytes was 1X10^6/60mmDish at the beginning of culture, 48 hours later, the number of hepatocytes was layered on PVLA, and 96 hours later, the number of hepatocytes with a diameter of about 100μm was layered. The process of sphereoid formation and the transformation of hepatocyte adhesion protein were observed. Methods: After incubation, the sphereoid was isolated and immobilized, and the antibody was modulated by indirect method. The culture time is about 48 days. The liver tissue is divided into two groups: the liver tissue and the liver tissue. 3:,4:,5: 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9, 10, 9:1, 9,