ミトコンドリア遺伝子異常症における体細胞モザイシズムの形成機構の解析

线粒体遗传病体细胞嵌合形成机制分析

• 批准号: 06770584
• 负责人: 小林 葉子
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770584/
• 关键词: ミトコンドリア異常症; ミトコンドリアDNA; Leber病; PCR

ミトコンドリア異常症では1人の患者で変異遺伝子がヘテロプラスミ-に存在し、その割合が症状発現の重要な因子である。1細胞での変異遺伝子の量及び分布を知ることは、変異遺伝子量と細胞障害性の発現との関連、さらに分配形式を知る上で重要である。今年度、細胞ごとの遺伝子型を解析する方法を検討し、変異遺伝子の細胞レベルでの分布を明らかにした。11778変異をもつLeber病大家系の2人の白血球より抽出したDNA(変異遺伝子の割合はそれぞれ80%と50%)を1μgから0.1pgまで段階希釈し、2段階のPCR法(25cycle×2)にて変異遺伝子を含むDNA断片を増幅、制限酵素で切断後アガロースゲル電気泳動後解析した。1μgから1pgまでは、バンドが認められ、変異遺伝子の割合はそれぞれの患者につき全サンプルで同じであった。このことは1細胞のmtDNAを解析することが可能である。また少ないコピー数を2段階PCR法で増幅してもアーチファクトが生じないことを示している。血液より分離した白血球は十分に希釈し、培養皿に移した後上澄みを取り替え洗浄し、micromanipulation法にて1細胞ごとに分離した。この方法により細胞浮遊中のDNA混入をなくすることが出来た。80%の割合で変異を認めるLeber病の患者の白血球25細胞を解析した。16細胞は変異mtDNAのみ、5細胞は正常mtDNAのみで、21/25は細胞内ホモプラスミ-を示した。Leber病の白血球では、細胞分裂に伴い2種類のmtDNAは一方のmtDNAをもつように両方向性分配されていくと考えられた。これはこの変異の白血球における細胞障害性が強くないからかもしれない。この結果は細胞分裂の頻度や1細胞あたりのmtDNAコピー数が個となる他の組織、あるいは他のミトコンドリア異常症では異なるものと考えられる。今後、この方法を培養細胞系に応用し、細胞内の2種類のmtDNAの動きやそれに影響を及ぼす因子について検討する予定である。

The presence of a variety of different genes in one patient is an important factor in the development of symptoms. 1. It is important to know the quantity and distribution of heterozygotes in cells, the relationship between the quantity of heterozygotes and the occurrence and distribution of cell damage. This year, the method of analyzing the gene type of the cell is discussed, and the distribution of the gene type of the cell is clarified 11778 different DNA fragments were extracted from leukocytes of 2 people in Leber disease family (different DNA fragments were separated from 80% to 50%). 1μg of DNA fragments were separated from 0.1pg of DNA fragments. 2-stage PCR method (25cycle×2) was used to analyze different DNA fragments after enzyme cleavage. 1μg It is possible to analyze the mtDNA of 1 cell. 2-stage PCR method to increase the number of samples The white blood cells were isolated by the method of micromanipulation. The method is to mix DNA into the cells. 80% of patients with Leber's disease have white blood cell 25-cell analysis. 16 cells showed abnormal mtDNA, 5 cells showed normal mtDNA, and 21/25 cells showed intracellular mtDNA. Leber disease leukocytes, cell division, two types of mtDNA, one side of mtDNA, directional distribution, two types of mtDNA The white blood cells of the two groups are highly toxic. The result is that the frequency of cell division is 1 cell, the number of mtDNA is 1 cell, the number of mtDNA is 1 cell, and the number of mtDNA is 1 cell. In the future, this method will be used to culture cell lines, and the effects of mitochondrial activity on cell lines and factors will be discussed.