反芻類家畜における形質転換動物作出技術の開発に関する研究

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Tg家畜作出における最大の課題は、Tg動物の作出効率がマウスに比べ著しく低いことである。家畜への遺伝子導入は、これまで、受精卵前核へのDNA顕微注入法によってのみ行なわれているが、胚発生の階段で、Tg胚を選別できれば、Tg動物の作出効率を顕著に向上させることができる。最近、Green Fluorescent Protein(GEP)をマーカーとするTg胚の選別法が開発されつつあるが、なお、胚におけるGFPの一過性発現と持続性発現との区別が明瞭でない。本研究は、マウス胚を材料に、enhancedGFP(EGFP)をCMVenhance・chiken β-actin promoterに連結した融合遺伝子(CMV・β-actin/EGFP)をマーカーとした高精度のTg胚選別法を確立するために行なったものである。C3B6F1マウス由来の受精卵前核にCMV・β-actin/EGFP遺伝子を顕微注入し生存胚を体外培養した。その後、4細胞、8細胞、桑実胚、胚盤胞期に、それぞれ蛍光顕微鏡(GF-1フィルター)で観察し、後期胚について、モザイク様に発光した胚と全体に発光した胚とに分類した。それらの胚の一部を、我々の研究室で開発したBal31・Dpnlを用いるTg胚選別法(Soe et al,1997)により、蛍光発光とTg胚との関係について解析した。他の胚は、偽妊娠ICRマウスの子宮へ移植し、生まれたマウスのTg個体について解析した。なお、対照には非発光胚を用いた。4細胞期および8細胞期で蛍光発光が観察された場合もあったが、大部分は桑実期以後に強い発光が観察された。Soeらの方法によりTg胚を解析した結果、発光胚の約80%以上がTg胚と判定された。一方、非発光胚でも極一部Tg胚の存在が確認された。なお、移植実験の解析は現在進行中である。また、胚におけるEGFPの発現が、培養液の鮮度に強く影響されることが認められた。以上の結果から、EGFPをマーカーとするTg胚の選別には、全体に発光する胚のみをTg胚として判定することが重要であると考えられ、本選別法が、Tg家畜の作出効率を向上させる上で手極めて有効な手段であることが確認された。