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反芻類家畜における形質転換動物作出技術の開発に関する研究

反刍家畜转基因动物生产技术开发研究

基本信息

批准号：
07556063
负责人：
東條英昭
金额：
$ 12.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至 1997
项目状态：
已结题

项目摘要

Tg家畜作出における最大の課題は、Tg動物の作出効率がマウスに比べ著しく低いことである。家畜への遺伝子導入は、これまで、受精卵前核へのDNA顕微注入法によってのみ行なわれているが、胚発生の階段で、Tg胚を選別できれば、Tg動物の作出効率を顕著に向上させることができる。最近、Green Fluorescent Protein(GEP)をマーカーとするTg胚の選別法が開発されつつあるが、なお、胚におけるGFPの一過性発現と持続性発現との区別が明瞭でない。本研究は、マウス胚を材料に、enhancedGFP(EGFP)をCMVenhance・chiken β-actin promoterに連結した融合遺伝子(CMV・β-actin/EGFP)をマーカーとした高精度のTg胚選別法を確立するために行なったものである。C3B6F1マウス由来の受精卵前核にCMV・β-actin/EGFP遺伝子を顕微注入し生存胚を体外培養した。その後、4細胞、8細胞、桑実胚、胚盤胞期に、それぞれ蛍光顕微鏡(GF-1フィルター)で観察し、後期胚について、モザイク様に発光した胚と全体に発光した胚とに分類した。それらの胚の一部を、我々の研究室で開発したBal31・Dpnlを用いるTg胚選別法(Soe et al,1997)により、蛍光発光とTg胚との関係について解析した。他の胚は、偽妊娠ICRマウスの子宮へ移植し、生まれたマウスのTg個体について解析した。なお、対照には非発光胚を用いた。4細胞期および8細胞期で蛍光発光が観察された場合もあったが、大部分は桑実期以後に強い発光が観察された。Soeらの方法によりTg胚を解析した結果、発光胚の約80%以上がTg胚と判定された。一方、非発光胚でも極一部Tg胚の存在が確認された。なお、移植実験の解析は現在進行中である。また、胚におけるEGFPの発現が、培養液の鮮度に強く影響されることが認められた。以上の結果から、EGFPをマーカーとするTg胚の選別には、全体に発光する胚のみをTg胚として判定することが重要であると考えられ、本選別法が、Tg家畜の作出効率を向上させる上で手極めて有効な手段であることが確認された。

The biggest problem of Tg animal production is that the production rate of Tg animals is lower than that of Tg animals. The introduction of embryos into livestock, the microinjection of DNA into the pre-nucleus of fertilized eggs, the selection of embryos, and the production rate of Tg animals are discussed. Recently, Green Fluorescent Protein(GEP) has been identified as a transient and persistent GFP protein. In this study, we established a high precision method for embryo selection by enhancing GFP (EGFP), CMV, chiken, β-actin promoter, and CMV, β-actin promoter. The CMV·β-actin/EGFP gene was microinjected into the pronucleus of the fertilized egg from which the C3B6F1 was derived, and the viable embryos were cultured in vitro. After the embryo, 4-cell, 8-cell, mulberry embryo, blastoderm cell stage, all the embryos were detected by light microscope (GF-1), and the late embryos were classified by light emission. The relationship between Tg and luminescence was analyzed using the Tg method (Soe et al,1997). ICR analysis of fetal and pseudo-pregnancy in uterus transplantation, birth and postnatal development However, the contrast is not used for light emission. The light emitted from the 4-cell stage to the 8-cell stage was detected in most cases, and the light emitted from the 8-cell stage was detected in most cases. Soe's method is based on Tg analysis results, and about 80% of Tg is determined. The existence of Tg embryos in a square, non-luminous embryo was confirmed. The analysis of the transplant is now in progress. The growth of EGFP and the freshness of culture medium are strongly influenced by the growth of EGFP. The above results show that the selection of Tg embryos is important, and the selection of Tg embryos is important.