H^+,K^+‐ATPaseファミリーの構造-機能相関についての分子生物学的研究

H^+,K^+-ATPase家族结构与功能关系的分子生物学研究

• 批准号: 07772159
• 负责人: 浅野 真司
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Toyama Medical and Pharmaceutical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07772159/
• 关键词: H^+,K^+‐ATPase; プロトンポンプ; 胃酸分泌; 能動輸送; 部位特異的変異導入; イオン認識; 遺伝子発現

1.胃H^+,K^+‐ATPaseの機能的な発現について胃H^+,K^+‐ATPaseは胃酸の分泌に携わるプロトンポンプである。これまで、このポンプについてはcDNAを機能的に発現することができなかったため、ポンプの構造と機能との関連についての研究が進んでいなかった。私は、ウサギの胃H^+,K^+‐ATPaseのα、βサブユニットのcDNAに修飾を施したのち、ヒト腎臓由来の培養細胞、HEK‐293に導入することによってこのATPaseを機能的に発現させることに成功した。2.胃H^+,K^+‐ATPaseの触媒中心やイオン認識部位への部位特異的な変異導入について前項に述べた機能的な発現系を用いて、H^+,K^+‐ATPaseの触媒中心やイオン認識部位に変異を導入し、その機能的な変化を観察した。触媒中心にリン酸化部位(Asp‐387)に変異を導入すると、変異体はすべて活性を失った。Asp→Gluという形でカルボキシル基を保持して側鎖の大きさを変えただけでも失活がおこった。このことから、リン酸化部位には厳格な一定の構造が要求されるものと考えられた。また、αサブユニットの4番目の膜貫通領域(M4)に存在するグルタミン酸残基(Glu‐345)に変異を導入すると、多くの変異体は活性を完全に失ったが、グルタミン変異体(E345Q)は、野生型の約40%の活性を保持した。この変異体は、K^+に対する親和性が低下するとともに、ATPに対する親和性が上昇していた。このことから、Glu‐345がK^+の認識に関与していること、またGlu‐345と原形質側のリン酸化部位Asp387、ATP結合部位Lys‐519をつなぐM4セグメントがATPの加水分解とイオンの認識、輸送とを結びつけるエネルギー伝達に重要な役割を果たすものと考えられた。

1. The function of gastric H^+, K ^+ ‐ ATPase is closely related to gastric acid secretion. The development of cDNA function is a key issue in the study of cDNA structure and function. The cDNA modification of H^+,K^+-ATPase in human stomach was successfully carried out in cultured cells derived from kidney and HEK-293. 2. The catalytic center of H^+, K ^+-ATPase in the stomach recognizes the site-specific variation of the site, and the site-specific variation of the site, and the site-specific variation of the site. The catalytic center is located at the acidified site (Asp-387). Asp→Glu → Glu → Glu This is the first time that the acid has been used. In addition, the presence of the allelic acid residue (Glu-345) in the membrane penetration domain (M4) of the 4-segment α- The affinity of K^+ is lower than that of ATP. The recognition of K^+ in Glu-345 and Asp-387, ATP binding site Lys-519 is related to the recognition, transport and synthesis of ATP.

项目成果

浅野 真司: "生物薬科学実験講座 ホルモン、生理活性物質" 広川書店, 256 (1996)

浅野真司：《生物制药科学实验课程激素和生理活性物质》广川书店，256（1996）

Shinji Asano: "Functional Expression of Gastric H^+,K^+‐ATPase and Site‐directed Mutagenesis of the Putative Cation Binding Site and the Catalytic Center" Journal of Biological Chemistry. 271. 2740-2745 (1996)

Shinji Asano：“胃 H^+、K^+-ATP 酶的功能表达以及假定的阳离子结合位点和催化中心的定点突变”《生物化学杂志》271。2740-2745 (1996)。