脳血管障害型痴呆誘発機構の分子生物学的研究:内因性原因物質の単離と発現制御

脳血管障害型痴呆モデル動物の確立をめざした研究が、報告者の所属する研究室においてこれまでになされており、両側総頸動脈永久結紮ラットが、同モデル動物として有用であることが、学習障害実験等により明らかにされている。同モデル動物では晩発性神経細胞死を生ずることや、その細胞死に先行して未知の蛋白が発現することが電顕レベルにおいて確認されている。本研究では発現蛋白の同定を遺伝学的手法を用いて試みた。両側総頸動脈永久結紮ラットおよび偽手術ラットの脳前部よりグアニジウム/塩化セシウム法によりtotal RNAを抽出し、oligo(dT)セルロースカラムによりpoly(A)^+mRNAを精製した。そのmRNAを用い、oligi(dT)プライマーと逆転写酵素supersciptにより単鎖cDNAを合成、さらにそれを鋳型に上記プライマーと任意のプライマーによりPCRを行い、二本鎖cDNAを得た。得られた二本鎖cDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、結紮群と偽手術群との発現cDNAを比較、異なる発現の見られたDNAのゲル部分を切り出し、PCRにより再び増殖することにより発現の異なる遺伝子を数種単離した。現在、各遺伝子をベクター中に組み込み、塩基配列の決定とin situ hybridizationによる発現部位の同定を行うための実験を進めている。なお、同様の方法により、抗うつ関連因子のクローニングを行い、約150塩基対の特異的配列を見いだしている。同配列は3'側の部分配列であると推定されるため、現在その全長のクローニングを行うと共に、うつ病との生理的関連性の解明をめざした研究も行っている。

脳血管障害型痴呆モデル動物の確立をめざした研究が、報告者の所属する研究室においてこれまでになされており、両側総頸動脈永久結紮ラットが、同モデル動物として有用であることが、学習障害実験等により明らかにされている。同モデル動物では晩発性神経細胞死を生ずることや、その細胞死に先行して未知の蛋白が発現することが電顕レベルにおいて確認されている。本研究では発現蛋白の同定を遺伝学的手法を用いて試みた。両側総頸動脈永久結紮ラットおよび偽手術ラットの脳前部よりグアニジウム/塩化セシウム法によりtotal RNAを抽出し、oligo(dT)セルロースカラムによりpoly(A)^+mRNAを精製した。そのmRNAを用い、oligi(dT)プライマーと逆転写酵素supersciptにより単鎖cDNAを合成、さらにそれを鋳型に上記プライマーと任意のプライマーによりPCRを行い、二本鎖cDNAを得た。得られた二本鎖cDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、結紮群と偽手術群との発現cDNAを比較、異なる発現の見られたDNAのゲル部分を切り出し、PCRにより再び増殖することにより発現の異なる遺伝子を数種単離した。現在、各遺伝子をベクター中に組み込み、塩基配列の決定とin situ hybridizationによる発現部位の同定を行うための実験を進めている。なお、同様の方法により、抗うつ関連因子のクローニングを行い、約150塩基対の特異的配列を見いだしている。同配列は3'側の部分配列であると推定されるため、現在その全長のクローニングを行うと共に、うつ病との生理的関連性の解明をめざした研究も行っている。