ラットIch-1/Nedd2遺伝子の構造及び発見の解析

大鼠Ich-1/Nedd2基因的结构分析与发现

• 批准号: 07770015
• 负责人: 佐藤 昇
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770015/
• 关键词: アポトーシス; Nedd2; Ich-1; ICE

細胞死(アポトーシス)の細胞内機構を解析する目的で、細胞死の原因遺伝子の一つとして同定されNedd2/Ich1遺伝子のクローニングを試みた。マウスの塩基配列を参考に作製されたプライマーを用いてRT-PCR法を施行し増幅されたDNA断片をプローブとしてPC12細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングした。得られたcDNAクローンの塩基配列を決定したところラットNedd2/Ich1は452アミノ酸残基から成ることが予想され、ヒト及びマウスのそれと高い相同性を有することが明かになった。ラットNedd2/Ich1のアミノ酸配列にはICE関連遺伝子ファミリーにみられるQACRGというシステインプロテアーゼとしての活性中心のモチーフも存在されていた。次にNedd2/Ich1遺伝子産物の機能を解析するために抗体作製を計画した。Nedd2/Ich1のC末端330-452アミノ酸残基部分をマルトース結合蛋白質のC末端に連結した融合蛋白質を大腸菌で作らせた。融合蛋白質をアミロースカラムで精製してウサギに免疫して抗Nedd2/Ich1血清を得た。この抗血清でPC12細胞のイムノブロットを施行したところNedd2/Ich1と予想されるバンドが分子量約28.000付近に確認された。PC12細胞は無血清培地で培養するとアポトーシスで死ぬが、その経時経過をNedd2/Ich1のイムノブロットで観察すると経過中Nedd2/Ich1のバンドが常に認められまたその発現量に著明な変化が認められないことから、1)Nedd2/Ich1の発現量ではなく活性の有無が重要である、2)Nedd2/Ich1の基質(未だに未知)の量が重要である、3)Nedd2/Ich1以外のICE関連遺伝子ファミリーが細胞死に関与している、などの可能性を今後検討する予定である。

To analyze the intracellular mechanism of cell death, we try to determine the cause of cell death and the origin of Nedd2/Ich1. The gene sequence of PC12 cells was determined by RT-PCR The nucleotide sequence of the cDNA is determined by the sequence of the nucleotide sequence of Nedd2/Ich1. Nedd2/Ich1 is an active acid sequence that is related to the presence of an ICE-dependent molecule. Next, Nedd2/Ich1 gene product function analysis and antibody production planning Nedd2/Ich1 C-terminal 330-452 amino acid residues are linked to the C-terminal of the binding protein. The fusion protein was purified and the anti-Nedd2/Ich1 serum was obtained. The antiserum was confirmed to have a molecular weight of approximately 28.000. PC12 cells were cultured in serum-free medium for a period of time, and the amount of Nedd2/Ich1 matrix (unknown) was important. 3) ICE-related genes other than Nedd2/Ich1 are closely related to cell death and the possibility of future investigation is predetermined.