神経内分泌細胞におけるシステインプロテアーゼインヒビターの機能解析

半胱氨酸蛋白酶抑制剂在神经内分泌细胞中的功能分析

• 批准号: 06770018
• 负责人: 佐藤 昇
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Iwate Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06770018/
• 关键词: PC12; シスタチンβ; アンチセンスオリゴヌクレオチド法; トランスフェクション; bcl-2; アポトーシス; 神経分化

細胞質に存在するリソゾームシステインプロテアーゼの一つであるシスタチンβのPC12細胞における機能を明らかにする目的でアンチセンスオリゴヌクレオチド法によるシスタチンβの発現抑制を試みた。複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用意したが有為な発現抑制は認められなかった。特にNGFで神経様に分化させる実験など長時間におよぶ系では安定した結果を得るのが難しいと考えられた。そこでアンチセンスオリゴヌクレオチド法による一過性の発現抑制ではなくアンチセンスベクターによる恒常的な発現抑制の系を検討することにした。その手始めとしてPC12細胞が発現ベクター導入によって持続的かつ安定な発現クローンを得るのに適した細胞であるか検討してみた。ヒト原型癌遺伝子bc1-2のcDNAをRSV-LTRプロモーターに連結したベクターを作製しリン酸カルシウム法によりPC12細胞に遺伝子を導入したところ6つの安定発現株を得た。いずれの株においてもヒトbc1-2がmRNA及び蛋白の両方のレベルでNGFによる神経分化誘導や血清除去によるアポトーシスの誘導刺激においても安定して発現していることをノーザンブロット法及びイムノブロット法にて確認した。このことよりRSV-LTRプロモーターによって発現が支配されるベクターがPC12細胞において有効に機能することが明らかになった。そこで現在シスタチンβのcDNAをRSV-LTRプロモータに逆向きに組み込んだ発現ベクターを作製している。このベクターは恒常的にシスタチンβのアンチセンスmRNAを発現することが予想され、その結果PC12細胞におけるシスタチンβの蛋白レベルでの発現が抑制されることが期待できる。

Cytoplasm に exist す る リ ソ ゾ ー ム シ ス テ イ ン プ ロ テ ア ー ゼ の a つ で あ る シ ス タ チ ン beta の PC12 cells に お け る function を Ming ら か に す る purpose で ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド method に よ る シ ス タ チ ン beta の 発 inhibit を now try み た. Plural の ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド を intention し た が for な 発 inhibit は now recognize め ら れ な か っ た. Special に model NGF で god 経 others に differentiation さ せ る be 験 な ど long に お よ ぶ department で は settle し た results る を の が difficult し い と exam え ら れ た. そ こ で ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド method に よ る transient の 発 now inhibit で は な く ア ン チ セ ン ス ベ ク タ ー に よ る constant な 発 inhibit の is now を beg す 検 る こ と に し た. Beginning そ の hand め と し て PC12 cells が 発 now ベ ク タ ー import に よ っ て hold 続 か つ settle な 発 now ク ロ ー ン を must る の に optimum し た cells で あ る か beg し 検 て み た. ヒ ト prototype carcinoma heritage 伝 son bc1-2 の cDNA を RSV - LTR プ ロ モ ー タ ー に link し た ベ ク タ ー を cropping し リ ン acid カ ル シ ウ ム method に よ り PC12 cells に heritage 伝 son を import し た と こ ろ 6 つ の settle 発 now た を strains. い ず れ の strains に お い て も ヒ ト bc1-2 が mRNA and protein び の struck party の レ ベ ル で model NGF に よ る god 経 induction や serum remove に よ る ア ポ ト ー シ ス の induced stimulation に お い て も settle し て 発 now し て い る こ と を ノ ー ザ ン ブ ロ ッ ト method and び イ ム ノ ブ ロ ッ ト method に て confirm し た. こ の こ と よ り RSV - LTR プ ロ モ ー タ ー に よ っ て 発 が now dominate さ れ る ベ ク タ ー が PC12 cells に お い て have sharper に function す る こ と が Ming ら か に な っ た. Now そ こ で シ ス タ チ ン beta の cDNA を RSV - LTR プ ロ モ ー タ に reverse き に group み 込 ん だ 発 now ベ ク タ ー を cropping し て い る. こ の ベ ク タ ー は constant に シ ス タ チ ン beta の ア ン チ セ ン ス mRNA を 発 now す る こ と が to think さ れ, そ の results PC12 cells に お け る シ ス タ チ ン beta の protein レ ベ ル で の 発 now が inhibit さ れ る こ と が expect で き る.

项目成果

Sato,N,et al.: "Neuronal differentiation of PC12 cells as a result of prevention of cell death by bc1-2" Journal of Neurobiology. 25. 1227-1234 (1994)

Sato,N,et al.：“bc1-2 预防细胞死亡导致 PC12 细胞的神经分化”《神经生物学杂志》。