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Maillard反応後期生成物の主要構造の決定、及びその生体内発現機構の解析

美拉德反应晚期产物主要结构测定及其体内表达机制分析

基本信息

批准号：
07770087
负责人：
荒木令江
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

高血糖に伴い多くの生体タンパク質が、非酵素的に糖付加反応を受けている。この反応はメイラード反応と呼ばれ、グルコース等の還元糖がタンパク質のリジン残基を介してシッフ塩基を形成し、アマドリ転位反応生成物に至る前期反応と、更に長期の反応を経て褐色変化、蛍光性あるいは分子間および分子内架橋を特徴とする後期生成物(Advanced Glycation End Protducts;AGE)に至る後期反応から構成される。AGEが糖尿病合併症や老化現象と密接に関係することが指摘されているが、その反応経路や生成物の構造に関する情報は極めて少なく、後期段階の如何なる構造体がこれらの病変発症と関係しているかなどの物質論的な情報に乏しいのが現状である。我々は、AGEの主要構造体の化学構造を決定と、その構造体の生体内発現機構の解明を目的として実験を行い下記のような成果を得た。1、主要蛍光物質X1の単離および構造解析最も単純なモデル化合物であるα-Tosyl-L-lysine(Tos-Lys)およびそのmethylester誘導体(Tos-Lys-oMe)やα-Acetyl-Lysine(Ac-lys)さらに単純なγ-Butyric acid(GABA)を用いて、グルコースとメイラード反応させ、蛍光・褐色性のAGE-Tos-Lys、AGE-Tos-Lys-oMe、及びAGE-GABAを調製した。逆相HPLC(C18)による解析の結果、反応時間に比例して顕著に蛍光性を増加させているピーク(主要蛍光物質)を逆相HPLCにより、それぞれのAGE化合物より単離精製した。1H-NMR、13C-NMR(COSY,HMQC,INADEQUATE)およびMass(FABMS,SIMS)スペクトルによる構造解析によって、それぞれの主要蛍光物質(EX330nm,EM450nm)が全く同一のものであることが判明しこれをAGEX1と命名した。AGEX1は2分子のグルコースが2分子のリジンのε-アミノ基を介して結合し、ピリジニウム環を形成している分子量832(AGEX1-Tos-Lysで計算した場合)の蛍光物質(4-keto-5-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)-1,7-bis[6-(N-tosyl-L-norleucyl)]-1,7-naphthyridinium)であることが判明した。2、X1の免疫化学的解析X1が生体タンパク質に発現しているかどうかを解析するために、X1-Tos-lysをカブトガニヘモシアニン(KLH)と重合させ、兎に免疫することにより抗X1-KLH抗血清を得た。抗X1-KLH抗血清はAGE-Tos-lys,AGE-Ac-lys,AGE-GABAのみならずAGE-BSAやその他のAGEタンパク質と有意に反応したが非修飾化合物やタンパク質とは反応しなかった。更に、生体タンパク質であるヒト正常レンズタンパク質とも反応し、その反応性は加齢に比例して増加した。これらの結果より、AGE-Lys誘導体より分離した主要蛍光物質AGEX1は、AGEタンパク質上に発現するAGE共通の主要構造体の一つであり、生体タンパク質にも発現して加齢により増加していることが判明した。

Hyperglycemia is accompanied by multiple biological reactions, non-enzymatic reactions, and sugar metabolism. The anti-retrogressive, anti-retrogressive, anti-retrogressive and anti-retrogressive residues are formed as intermediate, anti-retrogressive and anti-retrogressive products to prophase, long-term, anti-retrogressive, anti-retrogressive and anti-retrogressive products characterized by intermolecular and intramolecular bridging (Advanced Glycation End Products (AGE)) to post-retrogressive. Age is a complex disease, aging phenomenon and close relationship, and the structure of the disease is very small, and the structure of the disease is very small. The chemical structure of the main structure of the AGE is determined, and the mechanism of the occurrence of the structure in vivo is explained. 1. The structure analysis of X1, the main fluorescent substance, is the purest of the compounds: α-Tosyl-L-lysine(Tos-Lys), α-Acetyl-Lysine(Ac-Lys), γ-Butyric acid(GABA), AGE-Tos-Lys, AGE-Tos-Lys-oMe, AGE-GABA. Results of analysis by reverse-phase HPLC(C18), reaction time ratio, increase in photoluminescence (main photoluminescent substance), reverse-phase HPLC, purification of AGE compounds 1H-NMR, 13C-NMR (COSY,HMQC,INADEQUATE) and Mass(FABMS,SIMS) spectra were used to analyze the structure of the main fluorescent substances (EX330nm,EM450nm). AGEX1 is a fluorescent substance (4-keto-5-(1,2,3,4-tetrahydrohydroxybutyl)-1,7-bis[6-(N-tosyl-L-norleucyl)]-1,7-naphthylidine) with a molecular weight of 832(AGEX1-Tos-Lys calculation). 2. Immunochemical analysis of X1. X1-Tos-lys was detected in vivo, and anti-X1-KLH antiserum was obtained. Antisera against X1-KLH contain AGE-Tos-lys,AGE-Ac-lys,AGE-GABA and AGE-BSA as well as other antigenics. In addition, the proportion of organisms with high quality and high resistance increased. As a result, AGE-Lys inducer was isolated and the main fluorescent substance AGEX1 was identified as a common main structure of AGE.