血小板活性化因子合成酵素の活性化機構の解析

血小板激活因子合酶激活机制分析

基本信息

批准号：
07770100
负责人：
粂和彦
金额：
$ 0.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度の研究計画に沿った研究の結果、以下の結果を得た。1.血小板活性化因子(PAF)合成酵素の活性化機構の解析マウスマクロファージ系細胞株、RAW264.7を用いて、血小板活性化因子合成酵素(アセチル-CoA:リゾ血小板活性化因子アセチル転移酵素)の活性調整機構を検討した。この細胞株では、PAFそのもの、および、LPS(エンドトキシン)で、この酵素が活性化されたが、PAFによる活性化は、投与後1-2分をピークとして、5分後には、基底状態まで戻るのに対して、LPSによる活性化は15分程度をピークとし、その後も持続するようなパターンを示した。また、カルシウムイオノフォア(A23187)もほぼPAFと同様の時間経過で、この酵素活性を活性化すること、および細胞内カルシウム濃度の増加を阻害する、BAPTAにより、PAFによる活性化が阻害されたことより、PAFは細胞内カルシウム濃度の上昇により、この酵素を活性化していると考えられた。現在この結果は投稿準備中である。2.PAF合成酵素cDNAクローニング今年度は、準備段階として、PAF合成酵素活性をもたないホスト細胞の検索を行った。その結果、一過性発現によく使用されるCOS細胞は、強いPAF合成酵素活性をもつことがわかり、スクリーニングには不適であることがわかった。逆にCHO細胞は、ほとんどこの酵素活性を持たず、使用可能なことが示されたので、CHO細胞を用いた一過性発現の最適化を行い、リポフェクション法により、高い発現を得られる条件を見いだした。今後、ライブラリーのスクリーニングを開始する予定である。

根据今年的研究计划，从研究中获得以下结果。 1。使用小鼠巨噬细胞系RAW264.7研究了血小板激活因子（PAF）合酶的激活机制（PAF）合酶的活性调节机制（乙酰基-COA：乙酰骨骼激活因子乙酰转移酶）的机制。在该细胞系中，该酶被PAF本身和LPS（内毒素）激活，但是PAF的激活在给药后1-2分钟峰值，并在5分钟后返回到基础状态，而LPS的激活在约15分钟的峰值上达到峰值，此后继续进行。此外，钙离子载体（A23187）几乎在与PAF的同一时间过程中激活该酶活性，并抑制细胞内钙浓度的增加，而BAPTA抑制了PAF的激活，因此人们认为PAF通过增加细胞内钙浓度来激活该酶。结果目前正在准备提交。 2。今年的PAF合酶cDNA克隆，作为初步步骤，我们搜索了没有PAF合酶活性的宿主细胞。结果表明，通常用于瞬态表达的COS细胞具有强大的PAF合酶活性，并且不适合筛选。相反，CHO细胞几乎没有酶活性并能够使用，因此使用CHO细胞优化了瞬态表达，并通过脂肪触发发现获得高表达的条件。图书馆筛选计划将来开始。