神経細胞初期培養系を用いた概日周期・覚醒睡眠制御機構の解析

利用早期神经元培养系统分析昼夜节律/觉醒-睡眠控制机制

基本信息

批准号：
17024049
负责人：
粂和彦
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

われわれは、ショウジョウバエを用いて、概日周期・覚醒睡眠制御機構の解析を行っている。特に、われわれが樹立した、睡眠の量が減少したショウジョウバエの変異株、fumin(不眠、fmn)は、遺伝学的マッピングと、cDNA・ゲノムの配列決定により、ドーパミン・トランスポーター遺伝子の機能欠失変異であることが示されている(K.Kume et al. J. Neurosci.25:7377-7384,2005)。この変異株の解析から、ドーパミンは、ショウジョウバエが不動状態にある時の反応性そのものに関係していることを薬理学的な実験などで、確認中している。また、ショウジョウバエの概日周期の中枢は、脳の中の限られた数のニューロンであることが知られており、その多くがPDF (Pigment dispersing factor)というペプチドを産生するPDFニューロンである。そこで、ショウジョウバエの睡眠覚醒と概日周期の関係を調べるため、このPDFニューロンと、ドーパミンニューロンのそれぞれが蛍光蛋白質(GFP)でラベルされるショウジョウバエの系統を作成し、その脳を単離し、in vitroで培養する系を樹立した。従来、単離した昆虫の神経細胞は、不安定で長期培養は困難とされていたため、培養液の改良などにより、長期培養条件の検討を行った。その結果、マウスの初期培養で用いられている、マウス胎児脳の初期培養細胞の培養上清を加えることで、1週間以上の長期にわたって安定して初代培養できる条件が確立できた。この系では、単離した神経細胞が、神経突起を伸長できることまで確認している。現在、電気生理学的・分子生物学的性質を、解析中である。

我们使用果蝇分析昼夜节律周期和清醒的睡眠控制机制。特别是，我们建立了烟素突变体（Insomn，FMN），其睡眠量降低，已被证明是通过遗传映射和cDNA基因组测序的多巴胺转运蛋白基因中的功能缺失突变（K. Kume等人（K. Kume等人）（K. J. J.Neursci。25：7377-777-73384,2005）。从对这种突变株的分析中，我们通过药理学实验证实了多巴胺与果蝇处于固定状态时的反应性有关。此外，众所周知，果蝇的昼夜节律循环中心是大脑中数量有限的神经元，其中许多是PDF神经元，它们产生称为颜料分散因子（PDF）的肽。因此，为了研究果蝇中的睡眠觉醒和昼夜节律周期之间的关系，我们创建了一个系统，在该系统中，这些PDF神经元和多巴胺神经元用荧光蛋白（GFP）标记，将大脑分离并在体外培养。通常，孤立的昆虫神经元被认为是不稳定的，难以培养长期培养物，因此通过改善培养基和其他方法来研究长期培养条件。结果，通过在小鼠的初始培养中添加小鼠胎儿脑的初始培养细胞的培养上清液，建立了稳定原发性培养的条件，长期超过一周。在该系统中，可以证实孤立的神经元可以扩展神经突。目前，正在分析电生理和分子生物学特性。