Two-hybrid systemを利用したPKC標的タンパク質の同定と解析

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初期の目的を基本的に達成し、酵母Two-hybrid systemにより、PKCεのキナーゼドメインに特異的に結合する新規ヒトタンパク質、εBP1を、クローニングすることに成功した。タンパク質発現が困難なため生化学的な解析が遅れているが、以下の興味深い知見がすでに得られており、早急に発表したいと考えている。1.εBP1は、新しいタンパク-タンパク相互作用interfaceとして近年注目されているBTB/POZドメインを含むタンパク質ファミリーの一員であった。このドメインは、ホモ/ヘテロ多量体形成活性を介して細胞内で大きな構造体を形成し、クロマチン構造制御を通じた遺伝子発現制御、あるいは細胞骨格系の形成に関与していることが指摘されている。ヒト白血病の2種の癌原遺伝子(Bcl6/LAZ3、およびPLZF)がこのファミリーに属することも報告されている。ノーザンブロットの結果からは、eBP1が脳、筋肉を中心として普遍的に発現していることが明からとなった。2.εBP1はそのN末端のBTB/POZドメイン周辺において非常に複雑な可変スプライシングを受け、多様なアイソフォームとして発現している。3.COS細胞に強制発現させると、εBP1はアイソフォーム依存的な、しかしBTB/POZドメインタンパク質に特徴的な細胞内局在、すなわち、核内粒子様構造への局在、あるいは細胞質での巨大な繊維状の会合体への局在を示した。一方、HelaあるいはCOS細胞で発現している内在性のεBP1は、核周囲の繊維状構造に局在した。これらの細胞に、活性型PKOε変異体を同時に強制発現させると、上記外来性、および内在性εBPの局在する構造体にこれら活性型PKCε変異体が強く取り込まれることも明らかとなった。以上の結果は、εBP1が、活性化したPKCεに局在する場を与えることを一つの機能とする、細胞内構造タンパク質であることを示唆している。