血管平滑筋および内皮細胞の増殖・遊走におけるトロンボスポンディン1の機能

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1.発現ベクターの作製実験開始当初は発現ベクターのpCB6(+)(cytomegarovirus promoter, human growth hormone terminater; Dr. Frank Rauscher IIIから供与)に完全長トロンボスポンディン1(TSP1)cDNAを組み込む予定であったが、どうしてもクローニング出来ないため、発現ベクターを6.2kbのpCB6(+)から5.4kbのpcDNA3(Invitrogen)に、またTSP1のcDNAも3'-UTRをほとんど削除し4.4kbまでに短縮して現在クローニング中である。また同時に並行して、もともとのTSP1 cDNAのプラスミドベクター(hTSP1 cDNA/pBS KS(+))にcytomegarovirus promoter(0.6kb)を直接組み込む方法、retrovirus vectorを用いる方法も行っている。2.Mutant vectorの作製計画当初の通り、TSP1の3量体形成に関与するジスルフィド結合の252および256番目のシステインをグリシンにmiss sense(C252: TGC to GGC, C256: TGT to GGT)する変異遺伝子断片をPCR法より作製し、sequencingにより確認した。しかし、上述のごとく変異TSP1 cDNAの発現ベクターを作製するまでには至ってなく、上記と同様の方法を用いて変異TSP1 cDNA発現プラスミドの作製中である。