腎上皮細胞におけるNa/H交換輸送体の局在に関する研究

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ナトリウム/水素イオン交換輸送蛋白(Na/H exchanger : NHE)の各アイソフォーム(NHE-1, NHE-3)の上皮細胞における局在の検討をLLC-PK1細胞をモデル上皮として分子生物学的手法により解明することを目的とした。1。透過性のあるフィルター膜上にLLC-PK1細胞をconfluentに培養し、NH_4Clで酸性化後にBCECFを用いて、上皮側、基底側それぞれのNa^+依存性の細胞内pH上昇(NHE活性)を、HCO_3のない条件で測定した。2。上記の方法を用い、LLC-PK1細胞においては上皮側、基底膜側にアミロライドに対する感受性が異なるNHE活性が存在することが判明した。そこで上皮側にNHE-1が混入している可能性を明らかにする目的でLLC-PK1細胞のNHE-1 mRNAに対するantisense oligonucleotideを用いて、上皮側、基底膜側のNHE活性の抑制を検討した。その結果、NHE-1 cDNAの5'末端の配列に対するantisense oligonucleotideを用いて、基底膜側のNHE活性のみが抑制されることが判明した。以上からLLC-PK1細胞においてはNHE-1は基底膜側にのみ分布しているものと考えられた。3。すでにクローニングされているラットとラビットのNHE-3に共通して保存されている部分をprimerとしてLLC-PK1細胞のNHE-3 cDNAのPCRクローニングを試みている。現在、予想通りの大きさのPCR産物を得たところである。得られたNHE-3 cDNA cloneを、作成したNHE欠損fibroblastに発現させ機能を検討し、また得られたcDNA cloneに対するantisenseoligo nucleotideを作成し、上記と同様の機能抑制の有無からNHE-3のLLC-PK1細胞における分布を確認する予定である。