腎上皮細胞におけるNa/H交換輸送体の局在に関する研究

肾上皮细胞Na/H交换转运蛋白定位研究

• 批准号: 07770887
• 负责人: 花井 順一
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770887/
• 关键词: Na; H交換輸送体; antisense oligonucleotide; LLC-PK1細胞; 上皮細胞; 局在,極性

ナトリウム/水素イオン交換輸送蛋白(Na/H exchanger : NHE)の各アイソフォーム(NHE-1, NHE-3)の上皮細胞における局在の検討をLLC-PK1細胞をモデル上皮として分子生物学的手法により解明することを目的とした。1。透過性のあるフィルター膜上にLLC-PK1細胞をconfluentに培養し、NH_4Clで酸性化後にBCECFを用いて、上皮側、基底側それぞれのNa^+依存性の細胞内pH上昇(NHE活性)を、HCO_3のない条件で測定した。2。上記の方法を用い、LLC-PK1細胞においては上皮側、基底膜側にアミロライドに対する感受性が異なるNHE活性が存在することが判明した。そこで上皮側にNHE-1が混入している可能性を明らかにする目的でLLC-PK1細胞のNHE-1 mRNAに対するantisense oligonucleotideを用いて、上皮側、基底膜側のNHE活性の抑制を検討した。その結果、NHE-1 cDNAの5'末端の配列に対するantisense oligonucleotideを用いて、基底膜側のNHE活性のみが抑制されることが判明した。以上からLLC-PK1細胞においてはNHE-1は基底膜側にのみ分布しているものと考えられた。3。すでにクローニングされているラットとラビットのNHE-3に共通して保存されている部分をprimerとしてLLC-PK1細胞のNHE-3 cDNAのPCRクローニングを試みている。現在、予想通りの大きさのPCR産物を得たところである。得られたNHE-3 cDNA cloneを、作成したNHE欠損fibroblastに発現させ機能を検討し、また得られたcDNA cloneに対するantisenseoligo nucleotideを作成し、上記と同様の機能抑制の有無からNHE-3のLLC-PK1細胞における分布を確認する予定である。

A molecular biological approach to the study of the expression of Na/H exchanger (NHE) in LLC-PK1 cells is under way. 1。The Na +-dependent intracellular pH rise (NHE activity) of LLC-PK1 cells was measured under confluent culture, NH_4Cl-acidified BCECF, epithelial and basal conditions. 2。The above method was used to identify the existence of NHE activity in LLC-PK1 cells with different sensitivity on both epithelial and basement membrane sides. To investigate the possibility of NHE-1 incorporation in the epithelial side of LLC-PK1 cells, the inhibition of NHE activity in the epithelial and basement membrane sides of LLC-PK1 cells was investigated. The results showed that the NHE-1 cDNA 5'-terminal alignment was inhibited by antisense oligonucleotide, and the NHE activity on the basement membrane side was inhibited. The above LLC-PK1 cells are distributed in the basement membrane side. 3。PCR amplification of NHE-3 cDNA from LLC-PK1 cells was performed using primers from LLC-PK1 cells. Now, I want to think about the PCR products of the big box. The NHE-3 cDNA clone was created and the NHE deficient fibroblast was detected. The cDNA clone was created and the LLC-PK1 cell was detected.

项目成果

花井 順一: "慢性腎不全の追行因子" 日本医事新報. 3696. 27-29 (1995)

Junichi Hanai：“慢性肾功能衰竭的以下因素” Nihon Iji Shinpo. 3696. 27-29 (1995)。