权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

新規ヒトユビキチン結合酵素遺伝子の単離と細胞機能における役割の解析

新型人泛素结合酶基因的分离及其在细胞功能中的作用分析

基本信息

批准号：
08670167
负责人：
岡野幸雄
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08670167/
关键词：
Ubiquitin-conjugating enzyme protein degradation FISH cDNA cloning

项目摘要

細胞内タンパク質のユビキチン(Ub)化は、細胞増殖・転写・DNA修復・受容体エンドサイトーシスなど種々の細胞機能に深く関与し、Ub化される基質蛋白質として癌遺伝子産物のMycやFos、癌抑制遺伝子のp53、成長因子受容体などが知られている。蛋白質のユビキチン化には3種の酵素が関与する。UbをATP依存性に活性化して自らとイソペプチド結合させるE1酵素(Uba)、E1酵素からUbを受け取り基質蛋白質にUbを付加するE2酵素(Ubc)、および基質蛋白質の認識に必要とされるE3酵素(Ubr)である。我々は、シグナル伝達分子の解析の過程で偶然Ub結合酵素(E2)の新規遺伝子の部分クローンを単離した。複数のcDNAライブラリーをスクリーニングし直してようやく得られた全翻訳領域を含むクローンがコードする蛋白質は、201アミノ酸からなり推定分子量22.1Kと考えられた。データベースを探索した結果、本クローンはN末端に数十アミノ酸を含むclass III E2の新規ヒト遺伝子と考えられた。報告論文中に引用された配列やEST配列との比較から、本クローンの最初のATGが開始コドンであり、UbcH8と命名した。UbcH8-GST融合蛋白質をコードする遺伝子を構築し、大腸菌に発現させてグルタチオンカラムを通して51kDaの蛋白質を精製した。UbcH8がE2酵素であることを確認するため、大腸菌に発現させてアイソトープ標識したUbおよび大腸菌に発現させたE1酵素存在下にUbcH8-GST融合蛋白質をインキュベートしたところUbcH8がUb化された大きさの位置に放射活性のバンドを認めた。このバンドは、E1酵素依存性に出現し、還元剤DTTの存在下に著明に減少した。この結果は、UbcH8がUbとイソペプチド結合したことを示しており、得られた遺伝子産物のUbcH8が機能的にもE2酵素であることが確認できた。さらに、我々は名古屋大学農学部・松田洋一博士との共同研究により、UbcH8遺伝子がヒトの第3染色体短腕24.2にマップされることをFISH法によって明らかにした。

The cytoskeleton of Ub was modified by DNA, and the cellular machinery of the recipient was modified by DNA. The cellular machinery of the receptor was deeply linked to the receptor, the basic protein was transformed into Myc, the tumor suppressor gene p53, and the growth factor receptor was known to be highly sensitive. Protein enzyme and enzyme enzyme. Ub, ATP-dependent, self-activating enzyme, binding enzyme E1 (Uba), enzyme E1 (Ub), gene protein (Ub), enzyme E2 (Ubc), gene protein (Ubr), enzyme E3 (Ubr). We have been able to analyze the process of Ub synthase (E2). Some of the new regulations are not available. The complex number, cDNA, acid, protein, and presumed molecular weight is 22.1 K, respectively. You need to explore the results of this experiment. You will find that there are dozens of acids in the N-terminal that contain class III E2 new regulations. In the report article, we refer to the listing of EST, the initial ATG of this report, and the naming of UbcH8. The UbcH8-GST fusion protein was expressed in E. coli, 51kDa protein in E. coli and E. coli in E. coli. The UbcH8 E2 enzyme was confirmed to be sensitive, and the fungus was shown to be aware that the UbcH8-GST fusion protein was present in the presence of the E1 enzyme. The radioactivity was detected in the location of the enzyme. There is no significant difference in the presence of E1 enzyme dependence, E1 enzyme dependence, and Yuan DTT. The results of the experiment, the combination of UbcH8 UbCO and UbcH8 UbTH8 and UbcH8 UbTH8 UbH8 UbH8 Ub Yoichi Matsuda, Ph.D., Department of Agriculture, Nagoya University, co-studied the short wrist of chromosome 3, UbcH8, 24.2, and FISH method.