ファージディスプレー法による機能性ヘム集合体のデザイン

使用噬菌体展示法设计功能性血红素聚集体

• 批准号: 10145230
• 负责人: 江崎 信芳
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10145230/
• 关键词: ファージディスプレー; グルタミン酸ラセマーゼ; ヘミン

本研究では、それ自体反応性に富む低分子化合物と蛋白質との複合体を作製し、その低分子化合物の持つ反応性を制御し、触媒として応用しうる新たな系を創出することを目標とした。具体的には、非ヘム酵素であるがミオグロビンと一次構造上の相同性を示し、ヘムと弱い結合をするグルタミン酸ラセマーゼ(GluR)を基に、ファージディスプレー法を用いて多様な結合様式をもつGluR-ヘム複合体を調製し、新しい機能を有するへムタンパク質複合体の構築を目指した。このためpBluescriptに由来するファージミド6D9wt-pComb3を基に、M13ファージコート蛋白質gpIIIのN-末端部分にGluRを融合タンパク質として発現するためのファージミド、GR-pCom3を構築した。ファージコート蛋白質上のGR発現は、ファージ液をSDS-PAGE上に展開し、GluR抗体でwestern blottingすることにより確認した。次ぎにEAH sepharose 4Bとヘミンを結合させた固定化ヘミンに対する、GR発現ファージの結合能を検討した。10^8個のGR発現ファージ粒子を含むファージ液と、対照実験として、ヘミンと構造上の類似性をもたないクロラムフェニコール誘導体に対する抗体を発現した同数のファージ(Phage-6D9)をヘミン・EAH sepharose 4Bカラムに供し、高塩濃度の緩衝液で洗浄した後、低塩濃度の緩衝液で溶出した。この結果、1.6x10^5個のGR発現ファージがカラムに結合したのに対し、Phage-6D9の結合は認められなかった。本研究では、GluRのファージコート蛋白質上への発現、およびpanningシステムの構築が確認できたが、ファージコート蛋白質、gpIII中のGluR融合タンパク質の存在確率は極めて低いものと考えられた。

The purpose of this study is to create a new system for the production of self-reactive low molecular weight compounds and protein complexes, and to control the reactivity of low molecular weight compounds. Specific enzymes, including non-enzyme enzymes, are shown to be identical in primary structure, weak in combination, and GluR-based. GluR-based methods are used to modulate GluR-based complexes, and novel functions are provided to construct GluR-based complexes. The origin of this protein is 6D9wt-pComb3, M13, and GluR fusion protein is found in the N-terminal part of gpIII. GR development on protein, development on SDS-PAGE, western blotting on GluR antibody EAH sepharose 4B was used to investigate the binding properties of immobilized cells. 10^8 particles were detected in a buffer solution containing a high concentration of EAH sepharose 4B and a buffer solution containing a low concentration of EAH sepharose 4B. The same number of antibodies were detected in a buffer solution containing a high concentration of EAH sepharose 4B and a buffer solution containing a low concentration of EAH sepharose 4B. The result is that 1.6x10^5 GR's are found in combination with Phage-6D9 's. In this study, we confirmed the existence of GluR fusion protein in protein, protein and protein in gpIII.