2-ハロ酸デハロゲナーゼ反応の立体特異性を規定するタンパク質構造と触媒機構

决定2-卤酸脱卤酶反应立体特异性的蛋白质结构和催化机制

• 批准号: 08680682
• 负责人: 江崎 信芳
• 金额: --
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680682/
• 关键词: デハロゲナーゼ; 2-ハロ酸; イオンスプレー質量分析装置; エステル中間体; 反応機構; 部位特異的変異

L-2-ハロ酸デハロゲナーゼは、L-2-ハロ酸の加水分解的脱ハロゲン反応を触媒する酵素で、L-ハロ酸のみを基質とし立体反転を伴ってD-ヒドロキシ酸を生成する酵素(L-DEX)や、D,L-両ハロ酸に作用するもの(DL-DEX)などが見出されている。本研究では、酵素タンパク質の分子進化の解明に資することを目的に、Pseudomonas sp.YLのL-DEXとPs.putida AJ-1のDL-DEXの構造と機能の解析を行った。L-DEXとヒドロキシルアミンを基質存在下で反応させた場合、酵素の失活が認められた。失活酵素のイオンスプレー質量分析装置などによる解析から、Asp10が修飾されてアスパラギン酸β-ヒドロキシム酸カルボキシアルキルエステルが生成している可能性が示された。この結果は、水よりも求核性が高いヒドロキシルアミンが、水分子の代わりにエステル中間体を攻撃し、Asp10が修飾されて酵素が失活することを示唆し、L-DEXの反応では、Asp10が求核性触媒基をして基質a-炭素に作用し、エステル中間体が形成されることが予想された。またAsp10近傍のAsp180の変異酵素であるD180Nと基質を反応させ、質量分析を行ったところ、変異酵素では基質に相当する分子量の増加が見られた。タンデムMS-MS解析により、この増加はAsp10の修飾に伴うことも確認され、Asp180はエステル中間体の加水分解反応に関与することが判明した。一方、本研究ではDL-DEXをコードする遺伝子の全一次配列を明らかにするとともに、DL-DEXと一次構造上の相同性を示すD-2-ハロ酸デハロゲナーゼとの間で保存されている26残基の極性アミノ酸の部位特異的変異を行い、DL-DEXのThr65、Glu69、Asp194が、D-,L-どちらの基質との反応についても必須であることを明かにした。

L-2-hydroxy-3-carboxylic acid (L-DEX),L-hydroxy-3-carboxylic acid (DL-DEX), L-hydroxy-3-carboxylic acid (DL- In this study, we investigated the molecular evolution of Pseudomonas sp. YL and Ps.putida AJ-1 and the structure and function of DL-DEX. L-DEX is the enzyme inactivation pathway in the presence of a substrate. Inactivated enzyme protein analysis device for the analysis of protein, Asp10 modification of the enzyme protein β-deoxy acid, Asp10 modification of the enzyme protein, Asp 10 modification of the enzyme protein. The results are as follows: water molecules are used to attack nuclear catalysts, Asp10 is modified to inactivate enzymes, L-DEX is used to react with nuclear catalysts, Asp10 is used to form nuclear intermediates. Asp180 and its related enzymes increased in molecular weight due to the reaction and mass analysis. MS-MS analysis of Asp10 and Asp180 was carried out to determine the relationship between Asp10 and Asp180. In this study, DL-DEX and DL-DEX showed the structural identity of D-2- 2-D-2-D-2 - 2-D-2 - 2-D-2 - 2-D-2 - 2-D-2 - 2-D-2-

项目成果

Ji-Quan Liu: "Paracatalytic Inactivation of L-2-Haloacid Dehalogenase from Pseudomonas sp.YL by Hydroxylamine" The Journal of Biochemistry. 272巻6号. 3363-3368 (1997)

Ji-Quan Liu：“羟胺对假单胞菌 YL 的 L-2-卤酸脱卤酶的副催化灭活”，《生物化学杂志》，第 272 卷，第 6 期。3363-3368 (1997)

Hisano Tamao: "Crystal Structure of L-2-Haloacid Dehalogenase from Pseudomonas sp.YL" The Journal of Biochemistry. 271巻34号. 20322-20330 (1996)

Hisano Tamao：“来自假单胞菌属 SP.YL 的 L-2-卤代酸脱卤酶的晶体结构”《生物化学杂志》，第 271 卷，第 34 期。20322-20330 (1996)

Hisano Tamao: "Crystallization and Preliminary X-Ray Crystallographic Studies of L-2-Haloacid Dehalogenase from Pseudomonas sp.YL" PROTEINS:structure,Function,and Genetics. 24巻. 520-222 (1996)

久野玉尾：“结晶与初步

Kenji Soda: "Bacterial L-2-Haloacid Dehalogenases:Structure and Catalytic Properties" Pure & Appl.Chem.68巻11号. 2097-2103 (1996)

Kenji Soda：“细菌 L-2-卤酸脱卤酶：结构和催化特性”Pure & Appl.Chem.Volume 68，Issue 11。2097-2103 (1996)