古細菌の蛋白質膜透過機構の解明と高度好塩古細菌を宿主とした膜蛋白質高生産系の構築

阐明古细菌的蛋白膜渗透机制并构建以高嗜盐古细菌为宿主的高产膜蛋白系统

• 批准号: 12876021
• 负责人: 江崎 信芳
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12876021/
• 关键词: 古細菌; 高度好塩古細菌; 蛋白質膜透過; SecY; SecE; 膜蛋白質; Haloferax volcanii; 蛋白質膜透過機構

真正細菌、真核生物とともに生物界を構成する三つのドメインの一つ古細菌の蛋白質膜透過装置を明らかにすることを目的として、高度好塩古細菌Haloferax volcaniiの膜透過装置を研究した。また、高度好塩古細菌を宿主とした膜蛋白質高生産系の開発を目的として、本菌の膜透過装置の増強を試みた。1.高度に精製したポリエチレングリコールを用いたH.volcaniiの形質転換法を確立した。2.H.volcaniiのゲノムライブラリーから単離した膜透過装置の構成因子(SecY、SecE)の遺伝子をH.volcanii用ベクターpMDS15のP2プロモーター下流に挿入し、制限酵素処理により、プロモーター下流にSecYあるいはSecE遺伝子が挿入されたDNA断片を得た。各断片を発現用シャトルベクターpMLH3およびpMDS30に各々挿入しSecEの発現用ベクターp30EとSecY発現用ベクターp3Yを構築した。またSecYとEの共発現用ベクターとしてp3YにSecE DNA断片を挿入したp3YEを構築した。これらにより、H.volcaniiの膜透過装置を増強できれば、膜蛋白質の生産量増加が期待される。3.膜透過装置を構成する新規因子を探索するため、架橋剤を用いてSecY近傍に存在する蛋白質の同定を試みた。架橋剤(EGS、Sulfo-EGS、DST)および架橋反応液中の塩濃度を変えることにより条件検討を行った。その結果、SecYに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析によりSecYと架橋されるタンパク質の存在が明らかとなった。架橋されたタシパク質の同定により、SecYやSecE以外の膜透過装置構成因子を明らかにできるものと考えられる。

A study on the membrane permeation device of archaea Haloferax volcanii, a highly pathogenic bacterium, was carried out. In addition, with the goal of developing a high-production system for membrane proteins that are highly resistant to archaea as hosts, we are trying to enhance the membrane permeation device of this bacterium. 1. A highly refined method of physical transformation of H.volcanii 2. H. volcanii DNA Fragment of Component (SecY, SecE) of Membrane Permeability Device with P2 of pMDS15 for restriction enzyme treatment Each fragment is developed using a sequence of events called pMLH3 and pMDS30, and each fragment is developed using a sequence of events called pMLH30 and pMDS30. The DNA fragments of the E gene were inserted into the p3 YE gene construct. The production of membrane protein is expected to increase due to the increase in membrane permeability of H.volcanii. 3. A new factor for membrane permeability is explored. A new factor for membrane permeability is explored. A new factor for membrane permeability is proposed. Bridging agent (EGS, Sulfo-EGS, DST) and bridging agent concentration in the solution are discussed. The result is that SecY can be used to detect the presence of antibodies. The structure of the membrane transmission device other than the bridge is clearly defined.