ファージディスプレーを用いた進化分子工学による酵素機能の改変

使用噬菌体展示通过进化分子工程修饰酶功能

• 批准号: 11132236
• 负责人: 江崎 信芳
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11132236/
• 关键词: ファージディスプレー; 進化分子工学; DnaK; グルタミン酸ラセマーゼ

本研究では、ファージディスプレー法の生物工学研究への応用として、E.coliの機能未知のHsp70ホモログの解析や酵素の高機能化に関する研究を行った。まず我々がE.coliに見い出した新しいHsp70ホモログ、Hsc62の基質選択性について考察するため、ランダムな8残基のペプチドを呈示したファージライブラリーを用いて、DnaKとHsc62に結合するペプチドの相違を検討した。この結果、Hsc62とDnaKはともに疎水的アミノ酸を多く含むペプチドを呈示したファージと結合したが、Hsc62の場合には、DnaKに比べて酸性アミノ酸含量の多いペプチドを好む傾向が得られた。これはHsc62のペプチド結合部位に、DnaKではMetとなっているHis残基が存在するというホモロジーモデリングの結果を反映していた。本研究ではまた、ファージディスプレーを用いた進化分子工学の手法の効率化を目指した。進化分子工学の手法により、ある酵素の基質特異性を転換する場合は、遺伝子にランダム変異を加え、酵素がその基質と反応するようになった場合にのみ、宿主の生育が可能となるような系を構築する。しかし宿主細胞への基質の取り込み能が低い場合には、酵素を菌体外へ分泌させるなどの必要がある。この問題を解決する方法として、ファージコート上に標的酵素を発現させることを考え、モデルとして、グルタミン酸に特異性が高いPedlococcus pentosaceusのグルタミン酸ラセマーゼのアスパラギン酸ラセマーゼへの変換を検討した。この結果、M13ファージコート上へのGluR融合タンパク質の発現に成功したが、酵素活性は検出されなかった。これは融合タンパク質蛋白質の発現量が少ないか、当初モノマーと考えられていたGRがダイマーであったためと考えられた。

This study is aimed at studying the application of biotechnological methods in the analysis of E.coli Hsp70 and the high functionalization of enzymes. A novel approach to matrix selectivity of Hsp70 and Hsc62 in E.coli has been developed. The selection of residues from Hsp70 and Hsc62 has been demonstrated. The interaction between DnaK and Hsc62 has been discussed. The results showed that Hsc62 and DnaK had a higher acid content than Hsc62 and a higher acid content than DnaK. This is reflected in the presence of Hsc62 and its binding sites, DnaK and Met residues. This study is aimed at improving the efficiency of evolutionary molecular engineering. Evolutionary molecular engineering techniques include: enzyme substrate specificity; gene differentiation; enzyme substrate specificity; and host fertility. The host cell matrix can be extracted from the medium and secreted from the medium. The method for solving this problem is to investigate the occurrence of target enzymes in the liver, and to investigate the occurrence of target enzymes in the liver. As a result, the GluR fusion protein in M13 was successfully developed and the enzyme activity was detected. The amount of protein produced by the fusion protein was reduced.