脳に存在する生物時計細胞のリアルタイム追跡と光情報伝達機構

大脑生物钟细胞实时追踪及光学信息传输机制

基本信息

批准号：
10169213
负责人：
岡野俊行
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

交付申請書に記載の研究実施計画に沿って研究を進め、以下の知見を得た。【概日時計細胞の時刻情報可視化】顕微鏡観察下において連続的に灌流培養しながらニワトリ松果体細胞・ラット視交叉上核細胞を分散培養するシステムを完成した。次に個々の細胞の時刻を蛍光強度として検出するため、転写量が日周変動するマウスper1遺伝子のプロモーター領域をクローニングした。この下流に短寿命型GFPの遺伝子(d2EGFP)を繋ぎレポーターコンストラクトを作製した。【時計や光応答に関連する遺伝子の単離】松果体細胞を用いたディファレンシャルディスプレイ解析を行い、時刻依存的に転写される遺伝子を探索した。その結果、分子シャペロンの一種であるHSP90遺伝子の転写量が日周変動することを見出した。【松果体・脳深部の光情報伝達経路と時計発振系の解析】ニワトリ松果体Gαの全一次構造決定に続いて、松果体のG蛋白質が光受容蛋白質ピノプシンと共存すること、Gt_1αおよびG_<11>αが光刺激依存的に光受容蛋白質から解離することを明らかにした。これらのことから、Gt_1を介した既知の光情報伝達経路の他に、G_<11>αを介した全く新しい経路が存在することが強く示唆された。これと並行して、概日時計への光入力系にチロシンリン酸化蛋白質が関与している可能性を検討した。その結果、松果体MAPキナーゼが光刺激の直後に脱リン酸化されること、さらにMAPキナーゼのチロシンリン酸化量および活性は恒暗条件下においても概日リズムを示すことがわかった。また、MEKの阻害剤(PD98059)を培養松果体に投与すると、概日時計の位相シフトが観察された。これらのことから、MAPキナーゼは概日時計を構成する分子であり、MAPキナーゼの活性化・不活性化のサイクルは、概日時計が駆動するために必要であることが明らかになった。

该研究是根据申请表中列出的研究实施计划进行的，并获得了以下发现。 [可视化昼夜节律细胞的时间信息]系统完成了一个系统，以分散鸡松果细胞和大鼠骨上核细胞的培养，同时在微观观察下连续灌注培养。接下来，为了检测单个细胞的时间为荧光强度，即小鼠PER1基因的启动子区域，在克隆时，每个日昼夜的转录量变化。通过连接下游的短寿命GFP基因（D2EGFP）来制备记者构建体。 [与时钟和光反应有关的基因的隔离]使用松果体细胞进行差异显示分析，以搜索以时间依赖性方式转录的基因。结果，发现Hsp90基因的转录量（一种分子伴侣）的转录量会波动昼夜。 [分析松果体和深脑中的光信息途径和时钟振荡系统]在确定鸡松果腺Gα的总主要结构之后，我们发现松果体腺G蛋白与光感受器蛋白pinopsin共存，并从GT_1α和G_1α和G__ <11>α分离光蛋白蛋白质中，以此为基础。这些结果强烈表明，除了通过GT_1的已知光学信号通路外，还通过G_ <11>α提供了全新的途径。同时，我们研究了酪氨酸磷酸化蛋白参与光学输入系统的可能性。结果，发现松果体MAP激酶在光刺激后立即被去磷酸化，并且即使在恒定的黑暗条件下，MAP激酶酪氨酸磷酸化和活性的数量和活性也会显示出昼夜节律。此外，当对培养的松果体施用MEK（PD98059）的抑制剂（PD98059）时，观察到昼夜节律的相移。这些发现表明，MAP激酶是构成昼夜节律的分子，并且MAP激酶的激活和灭活循环对于驱动昼夜节律是必要的。