ミオシン軽鎖キナーゼにより調節される細胞内Ca^<2+>流入機構の分子生物学的検討

肌球蛋白轻链激酶调控细胞内Ca^2+内流机制的分子生物学研究

• 批准号: 10169223
• 负责人: 渡邊 裕司
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Hamamatsu University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10169223/
• 关键词: カルシウムイオン; ミオシン軽鎖キナーゼ; マクロファージ

【目的】非興奮性細胞において細胞内Ca^<2+>ストアにより調節される容量依存性Ca^<2+>流入機構が存在するがそのメカニズムは明らかではない。本研究では、ヒトマクロファージの容量依存性Ca^<2+>流入機構におけるミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)の役割について検討した。【方法】Ficoll-Paqueを用い遠心分離したヒトマクロファージを用いた。細胞内Ca^<2+>濃度の変化はfura-2/AMを負荷後340/380nmの励起波長による蛍光強度比より評価した。ミオシン軽鎖(MLC)リン酸化は、Stullの方法に準じUrea Gel Electrophoresisを用いたWestern Blottingにより定量化した。【結果】(1)小胞体Ca^<2+>-ATPaseの阻害剤であるthapsigargin(TG:lμM)およびcyclopiazonic acid(CPA:100μM)投与により細胞内Ca^<2+>濃度は1μM以上の持続的な上昇を認めた。細胞外Ca^<2+>非存在下では、TGおよびCPA投与にて一過性の軽度な上昇を認めたが持続的な上昇は認められなかった。(2)MLCK阻害剤であるML-9(100μM)およびwortmannin(100μM)は、TGおよびCPA刺激時の細胞外からのCa^<2+>流入をほぼ完全に抑制したが、細胞内貯蔵部位からのCa^<2+>動員には影響を及ぼさなかった。(3)TG投与によりMLCリン酸化が促進したが、ML-9およびwortmanninはこのリン酸化をほぼ完全に抑制した。【総括】ヒトマクロファージにおいても血管内皮細胞と同様にMLCKにより調節される容量依存性Ca^<2+>流入機構が存在した。非興奮性細胞における容量依存性Ca^<2+>流入調節にMLCKが中心的な役割をはたすことが示唆された。

[Objective] Intracellular Ca^<2 +> flux regulation in non-excitable cells exists as a capacity-dependent Ca^<2+> influx mechanism. This study investigates the capacity dependence of Ca^<2+> on the inflow mechanism of MLCK. [Method] Ficoll-Paque Changes in intracellular Ca^<2+> concentration were evaluated by fluorescence intensity ratio at excitation wavelengths of 340/380nm after loading. Urea Gel Electrophoresis is quantified by Western Blotting. [Results](1) Thapsigargin(TG: 1 μM) and cyclopiazonic acid(CPA:100μM) inhibited intracellular Ca ^<2+>-ATPase activity and increased intracellular Ca^<2+> concentration above 1μM. In the absence of extracellular Ca^<2+>, TG and CPA concentrations increase transiently and continuously. (2)MLCK inhibitor ML-9(100 μ M) and wortmannin(100 μ M) completely inhibited extracellular Ca^<2+> influx and Ca^<2 +> mobilization from intracellular storage sites during TG and CPA stimulation. (3)TG The MLCs are activated and ML-9 is activated and wortmannin is inhibited. [Summary] The presence of capacity-dependent Ca^<2+> influx mechanisms in vascular endothelial cells and MLCK regulation The capacity dependence of non-excitable cells on Ca^<2+> influx regulates the activity of MLCK.