1分子蛍光イメージング法を用いた分子シャペロンによる蛋白質折れたたみ機構の解析

利用单分子荧光成像方法分析分子伴侣的蛋白质折叠机制

• 批准号: 10172231
• 负责人: 船津 高志
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10172231/
• 关键词: 蛍光顕微鏡; 1分子イメージング; シャペニロン

シャペロニンGroELはATP存在下でGroESと相互作用しながらタンパク質の折れたたみを助けている。GroELとGroESの結合解離のサイクルがタンパク質の折れたたみとどのように共役しているかを調べるための第一歩として、GroELとGroESをそれぞれ異なる蛍光色素で標識し、1分子蛍光イメージング技術を用いて結合解離を解析した。蛍光色素を選択的に標識するためGrOELの突然変異体(GroEL-D490C)を作製し、このシステインにテトラメチルローダミンマレイミドを反応させた。また、GroESはCy5-SEで標識した。いずれのタンパク質分子も色素分子と1対1に結合するように調製した。蛍光標識したGroELとGroESは、天然の標識していないものと同じタンパク質折りたたみ活性を有していた。GroELとGroESの相互作用の1分子イメージング観察は次のように行った。まずGroELをビオチンを介してガラス基板に固定し、これにATPとGroESそして基質タンパク質の還元ラクトアルブミンを加えた。まず全反射光学顕微鏡で1分子のGroELの位置を確認しておき、次に励起光を変えてGroESがGroELに結合する様子を観察した。その結果GeoESとGroELが結合解離を繰り返す様子を1分子レベルで可視化することに成功した。これは1分子のタンパク質同士の結合解離を可視化した最初の報告である。解析の結果、結合速度定数k_+は1x10^77M^<-1>S^<-1>となった。また、結合時間の分布は単純な指数分布ではなく、GroELとGroESは結合した後に構造変化を起こし、ある中間体を経て解離することが示された。この結果は、GroESが基質タンパク質をGroELの中央部に入れて蓋をし、折りたたみに必要な時間を確保するタイマーとして機能していることを示している。

シ ャ ペ ロ ニ ン GroEL は で in the presence of ATP GroES と interaction し な が ら タ ン パ ク qualitative の fold れ た た み を help け て い る. GroEL と GroES の combined with dissociative の サ イ ク ル が タ ン パ ク qualitative の fold れ た た み と ど の よ う に し total service て い る か を adjustable べ る た め の first step と し て, GroEL と GroES を そ れ ぞ れ different な る 蛍 pigment で logo し, 1 molecular 蛍 light イ メ ー ジ ン を グ technology with い て combined with dissociative を parsing し た. 蛍 photopigment を sentaku に logo す る た め GrOEL の suddenly - variants (GrOEL D490C を as し, こ の シ ス テ イ ン に テ ト ラ メ チ ル ロ ー ダ ミ ン マ レ イ ミ ド を anti 応 さ せ た. Youdaoplaceholder0, GroES で Cy5-SEで mark た. Youdaoplaceholder0 ずれ タ タ パ パ パ the pyrroid molecule and the apigenin molecule と 1-on-1 に binding するように modulating た た. 蛍 light logo し た GroEL と GroES は, natural の logo し て い な い も の と with じ タ ン パ ク quality folding り た た み active を have し て い た. GroELとGroES <s:1> interaction <e:1> 1 molecule メ メ ジ ジ グ観 グ観 cha メ sub-<e:1> ように った line った. ま ず GroEL を ビ オ チ ン を interface し て ガ ラ ス substrate に fixed し, こ れ に ATP と GroES そ し て matrix タ ン パ ラ ク qualitative の is yuan ク ト ア ル ブ ミ ン を plus え た. ま ず total reflection optical 顕 micromirror で 1 molecular の GroEL の position を confirm し て お き, times に excitation light を - え て GroES が GroEL に combining す る others child を 観 examine し た. そ の results GeoES と GroEL が combined with dissociative を Qiao り return す others child を 1 molecular レ ベ ル で visualization す る こ と に successful し た. Youdaoplaceholder2 れ 1 molecule of <s:1> タ パ パ パ the binding and dissociation of the molar with the molar を visualization <s:1> た initial molar report である. Analyze the result of the <s:1> and combine it with the velocity fixative k_+ となった 1x10^77M^<-1>S^<-1>となった. ま た, combined with time の は 単 pure な exponential で は な く, GroEL と GroES は combining し た に structural variations change after を up こ し, あ る intermediates を 経 て dissociation す る こ と が shown さ れ た. こ の results は, GroES が matrix タ ン パ ク qualitative を GroEL の に into the central department れ て cover を し, folding り た た み に を な time necessary to ensure す る タ イ マ ー と し て function し て い る こ と を shown し て い る.

项目成果

船津 高志: "1分子の生物分子モーターの動きと化学反応を観る" 医用電子と生体工学. 36. 228-234 (1998)

Takashi Funatsu：“观察单分子生物分子马达的运动和化学反应”《医疗电子与生物工程》36. 228-234 (1998)。

原田慶恵、船津高志: "蛍光顕微鏡システムによる生体分子の1分子イメージング" 細胞工学. 17. 626-633 (1998)

Yoshie Harada、Takashi Funatsu：“使用荧光显微镜系统对生物分子进行单分子成像”《细胞工程》17. 626-633 (1998)。

船津 高志: "蛋白質の運動と化学反応の1分子イメージング" 学術月報. 51. 1130-1133 (1998)

Takashi Funatsu：“蛋白质运动和化学反应的单分子成像”学术月报51。1130-1133（1998）。

Y.Harada, T.Funatsu et al.: "single molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time" Biophysical Journal. 76. 709-715 (1999)

Y.Harada、T.Funatsu 等人：“RNA 聚合酶-DNA 相互作用的实时单分子成像”生物物理学杂志。

S.Ishiwata, T.Funatsu and H.Fujita: "Contractile properties of thin(actin)filament-reconstituted muscle fibers" Adv.Exp.Med.Biol.453. 319-328 (1998)

S.Ishiwata、T.Funatsu 和 H.Fujita：“细（肌动蛋白）丝重建肌纤维的收缩特性”Adv.Exp.Med.Biol.453。