CBPの統合的転写制御機構の解析

申請者らは,哺乳類由来のCBPの108個のアミノ酸から構成されるC/H1領域に細胞特異的な強い転写活性化能があり,リガンドが不明な核内レセプターであるHNF4や最近注目を集めている接着因子であるβ-カテニンが,CBPと結合して転写を活性化することを見出してきた.さらに,CBPのコアクチベーター機能にRNAヘリケースA(RHA)を仲介とするcore RNA polymerase IIとの複合体形成が必要不可欠であることを報告してきた.そこで本研究は,以下の3点に焦点を絞りCBPの統合的転写制御機構を明らかにすることを目的とする.《1》 新規結合因子群の解析全長cDNAのクローニング:STAT2の全長cDNAをクローン化した結果,現在まで報告されているものとは違ったスプライシングが生じており,8アミノ酸残基からなる繰り返し配列が12回連続していた.《2》 RHA結合因子群の探索と解析Yeast two hybrid systemを用いてスクリーニングを行い,結合分子を同定する.そのため,RHAの4分割した機能ドメインをTrp選択マーカー遺伝子を持ちGal1のプロモーターの下流に組み込まれたGal4のDNA binding domainに接続しbait plasmidを構築した.イーストY190に一Trpで形質転換して,bait yeastを作製する.その後,cDNA library(マウス胎児,ヒト腎臓,及びマウス肝臓)をbait yeastに-Trp/-Leu/-Hisで形質転換して,約2週間培養後β-galによるフィルターアッセイを行いpositive cloneを選択しクローン化した結果,多くのポジティブクローンを得た.現在解析中である.《3》 転写活性化ドメインの個体レベルにおける機能的役割の解析普遍的に働くプロモーター(CMV-IE enhancer/chicken β-actin promoter-pCAGGS:東北大学加齢医学研究所・宮崎純一先生より供与)に転写活性化最小ドメイン(コザック配列を持つMetを付加)を接続した導入遺伝子を持つ,4系統のマウスを作製した.これらからホモ接合体を確立して,導入遺伝子の発現部位やそこでの表現型を見た結果,狭空間においてスピンするマウスや顎下腺に腫瘍を生じる系統が見出された.現在詳しく解析中である.

申請者らは,哺乳類由来のCBPの108個のアミノ酸から構成されるC/H1領域に細胞特異的な強い転写活性化能があり,リガンドが不明な核内レセプターであるHNF4や最近注目を集めている接着因子であるβ-カテニンが,CBPと結合して転写を活性化することを見出してきた.さらに,CBPのコアクチベーター機能にRNAヘリケースA(RHA)を仲介とするcore RNA polymerase IIとの複合体形成が必要不可欠であることを報告してきた.そこで本研究は,以下の3点に焦点を絞りCBPの統合的転写制御機構を明らかにすることを目的とする.《1》 新規結合因子群の解析全長cDNAのクローニング:STAT2の全長cDNAをクローン化した結果,現在まで報告されているものとは違ったスプライシングが生じており,8アミノ酸残基からなる繰り返し配列が12回連続していた.《2》 RHA結合因子群の探索と解析Yeast two hybrid systemを用いてスクリーニングを行い,結合分子を同定する.そのため,RHAの4分割した機能ドメインをTrp選択マーカー遺伝子を持ちGal1のプロモーターの下流に組み込まれたGal4のDNA binding domainに接続しbait plasmidを構築した.イーストY190に一Trpで形質転換して,bait yeastを作製する.その後,cDNA library(マウス胎児,ヒト腎臓,及びマウス肝臓)をbait yeastに-Trp/-Leu/-Hisで形質転換して,約2週間培養後β-galによるフィルターアッセイを行いpositive cloneを選択しクローン化した結果,多くのポジティブクローンを得た.現在解析中である.《3》 転写活性化ドメインの個体レベルにおける機能的役割の解析普遍的に働くプロモーター(CMV-IE enhancer/chicken β-actin promoter-pCAGGS:東北大学加齢医学研究所・宮崎純一先生より供与)に転写活性化最小ドメイン(コザック配列を持つMetを付加)を接続した導入遺伝子を持つ,4系統のマウスを作製した.これらからホモ接合体を確立して,導入遺伝子の発現部位やそこでの表現型を見た結果,狭空間においてスピンするマウスや顎下腺に腫瘍を生じる系統が見出された.現在詳しく解析中である.