糖ヌクレオチド輸送体を介する糖鎖リモデリングの基礎研究

1. 新規糖ヌクレオチド輸送体のcDNAクローニングと発現(1) UDP-Gal輸送体関連遺伝子一つであるUGTrel2cDNAについて、その全長の配列を確定した。さらに、これを出芽酵母Saccharomyces cerevisiae細胞中で発現させることに成功し、UGTrel2 cDNA産物がUDP-GlcNAcを特異的に輸送すること、すなわち、UGTrel2がヒトUDP-GlcNAc輸送体遺伝子であることを明らかにした。このcDNAを発現ベクターpMKIT-neoに挿入してCHO細胞に導入することにより、輸送体タンパク質はゴルジ膜に局在化することが明らかになった。UDP-GlcNAc輸送体mRNAは、各種の臓器に普遍的に発現していることが示された。(2)分裂酵母Schizosaccharomyces pombeのUDP-Gal輸送体遺伝子が2個のexonから構成されていることを明らかにし、RT-PCRによってUDP-Gal輸送体cDNAのコード領域全長の配列を明らかにした。さらに、このコード領域をpMKIT-neoに挿入してUDP-Gal輸送体欠損Lec8細胞中で発現させ、変異表現型の相補を利用して、cDNA産物がUDP-Gal輸送機能をもつことを証明することができた。2. 糖ヌクレオチド輸送体の機能領域の解析UDP-Gal輸送体とCMP-シアル酸輸送体のキメラ分子を種々構築し、その発現およびUDP-Gal輸送機能について検討した結果、N末およびC末の推定ループ部分には互換性が認められた。これは、delektionの導入による機能解析の結果ともconsistentであった。一方、N末端に最も近い推定膜貫通へリックスの置換は、UDP-Gal輸送活性を失わせるとともに、輸送体タンパク質の細胞内における安定性を大きく損なうことが示された。

1. 新規糖ヌクレオチド輸送体のcDNAクローニングと発現(1) UDP-Gal輸送体関連遺伝子一つであるUGTrel2cDNAについて、その全長の配列を確定した。さらに、これを出芽酵母Saccharomyces cerevisiae細胞中で発現させることに成功し、UGTrel2 cDNA産物がUDP-GlcNAcを特異的に輸送すること、すなわち、UGTrel2がヒトUDP-GlcNAc輸送体遺伝子であることを明らかにした。このcDNAを発現ベクターpMKIT-neoに挿入してCHO細胞に導入することにより、輸送体タンパク質はゴルジ膜に局在化することが明らかになった。UDP-GlcNAc輸送体mRNAは、各種の臓器に普遍的に発現していることが示された。(2)分裂酵母Schizosaccharomyces pombeのUDP-Gal輸送体遺伝子が2個のexonから構成されていることを明らかにし、RT-PCRによってUDP-Gal輸送体cDNAのコード領域全長の配列を明らかにした。さらに、このコード領域をpMKIT-neoに挿入してUDP-Gal輸送体欠損Lec8細胞中で発現させ、変異表現型の相補を利用して、cDNA産物がUDP-Gal輸送機能をもつことを証明することができた。2. 糖ヌクレオチド輸送体の機能領域の解析UDP-Gal輸送体とCMP-シアル酸輸送体のキメラ分子を種々構築し、その発現およびUDP-Gal輸送機能について検討した結果、N末およびC末の推定ループ部分には互換性が認められた。これは、delektionの導入による機能解析の結果ともconsistentであった。一方、N末端に最も近い推定膜貫通へリックスの置換は、UDP-Gal輸送活性を失わせるとともに、輸送体タンパク質の細胞内における安定性を大きく損なうことが示された。