糖ヌクレオチド輸送体を介する糖鎖リモデリングの基礎研究

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糖ヌクレオチドによる特異的基質の認識の機構を明らかにする目的で、2種類の基質特異的輸送体UDP-ガラクトース(UGT)およびCMP-シアル酸輸送体(CST)の間のキメラを種々構築し、それらの輸送特性について詳しく検討した。UGT/CSTキメラ輸送体のUGT活性、CST活性を迅速に評価する方法として、我々は、UGT欠損Lec8細胞およびCST欠損Lec2細胞中でキメラcDNAを発現させ、特異抗体を用いた免疫蛍光染色によってキメラ輸送体を検出すると同時に、個々の発現細胞への蛍光標識レクチン(GS-IIおよびPNA)の結合の有無によってその輸送体の輸送活性の有無を評価する簡便な方法を開発した。そして、UGTとCSTの間では、特定の領域のdomain swappingによって一方から他方への基質特異性の変換をもたらすような領域は同定できないことを示し、その原因はUDP-Gal認識領域とCMP-NeuAc認識領域が異なるためであることを明らかにした。すなわち、10本の膜貫通ヘリックスH1-H10の内、H1,H8-H10がUGT由来のものであればキメラ輸送体はUGT活性を示し、また、H2,H3,H7がCST由来であれば残りのヘリックスがどちらに由来するものであっても輸送体はCST活性を示すこと、この二つの条件を同時に満たすものはUDP-Gal/CMP-NeuAc二重特異的輸送活性を示すことが明らかになった。このことをさらに直接的に示すため、我々はUGTのH2,H3,H7をCST由来の配列で置換したキメラ分子を酵母のミクロソーム膜に発現させ、膜小胞を単離して放射性標識基質の輸送を直接測定することにより、キメラ輸送体がUDP-Gal,CMP-NeuAcの両者を輸送できることを実証した。そしてさらに、両者が共通のチャンネルを利用して利用されること、また、UDP-GlcNAc,UDP-Glc等はこのキメラ輸送体とは相互作用しないことを明らかにした。