単分子解析による遺伝子転写過程のイメージング

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本研究ではプロモーターlacUV5を含む600〜1000塩基対のDNAをテンプレートとし、大腸菌より精製したRNAポリメラーゼ(以後RNAP)を用いて転写過程の形態学的側面を明らかにしようとした。低角度回転蒸着法ではRNAP/DNA複合体の構造をを明瞭に観察できが、氷包埋法では十分なコントラストは得られなかった。現在エネルギーフィルタ顕微鏡を用いて観察している。新鮮状態に近いところでDNA/RNAP複合体を観察したいと考え更なる方法を考え中である。ここではこれまでに明らかになった低角度回転蒸着法による結果を簡潔に記す。nonspecific複合体では多くのRNAPがDNAに付着するが、接触ではなく抱え込むように結合している。また、RNAPの結合方向がまちまちであることから、DNAとRNAPとの結合には回転方向の自由度があり、mRNA合成中にRNAPが回転しながら進行している可能性を示唆した。Open complex複合体の形態学的な大きな特徴はRNAPを頂点としてDNAが折り曲げられることであるが、よく観察すると3'側のDNAがRNAPから出るところでさらに強いkinkが認められる。RNAPは大きなサブユニット2個と小さなサブユニット2個が重なりあった構造として見える。そしてDNAはRNAPの2βと2αとの間に形成される大きなチャンネルを明らかに貫通している。Elongation complexでは短くて細いmRNAがβとαとの間のチャンネルからテンプレートDNAとともに出てくるところが観察されたが、RNAPがプロモーターの位置を離れてしまうため、合成mRNAがRNAPの3'側の入り口か5'側の出口から出てくるのかは未だ確認できない。