単分子解析による遺伝子転写過程のイメージング

使用单分子分析对基因转录过程进行成像

• 批准号: 10878126
• 负责人: 臼倉 治郎
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10878126/
• 关键词: 遺伝子の転写; 蛋白質核酸複合体; 低角度回転蒸着法; mRNA; RNAポリメラーゼ; 構造解析; 電子顕微鏡; Open complex; 原子間力顕微鏡

本研究ではプロモーターlacUV5を含む600〜1000塩基対のDNAをテンプレートとし、大腸菌より精製したRNAポリメラーゼ(以後RNAP)を用いて転写過程の形態学的側面を明らかにしようとした。低角度回転蒸着法ではRNAP/DNA複合体の構造をを明瞭に観察できが、氷包埋法では十分なコントラストは得られなかった。現在エネルギーフィルタ顕微鏡を用いて観察している。新鮮状態に近いところでDNA/RNAP複合体を観察したいと考え更なる方法を考え中である。ここではこれまでに明らかになった低角度回転蒸着法による結果を簡潔に記す。nonspecific複合体では多くのRNAPがDNAに付着するが、接触ではなく抱え込むように結合している。また、RNAPの結合方向がまちまちであることから、DNAとRNAPとの結合には回転方向の自由度があり、mRNA合成中にRNAPが回転しながら進行している可能性を示唆した。Open complex複合体の形態学的な大きな特徴はRNAPを頂点としてDNAが折り曲げられることであるが、よく観察すると3'側のDNAがRNAPから出るところでさらに強いkinkが認められる。RNAPは大きなサブユニット2個と小さなサブユニット2個が重なりあった構造として見える。そしてDNAはRNAPの2βと2αとの間に形成される大きなチャンネルを明らかに貫通している。Elongation complexでは短くて細いmRNAがβとαとの間のチャンネルからテンプレートDNAとともに出てくるところが観察されたが、RNAPがプロモーターの位置を離れてしまうため、合成mRNAがRNAPの3'側の入り口か5'側の出口から出てくるのかは未だ確認できない。

This study で は プ ロ モ ー タ ー lacUV5 を containing む 600 ~ 1000 salt base の seaborne DNA を テ ン プ レ ー ト と し, coliform よ り refined し た RNA ポ リ メ ラ ー ゼ (RNAP later) を い て planning の morphology on the side of the writing process を Ming ら か に し よ う と し た. Low Angle back to the planning method of steamed で は RNAP/DNA complex の tectonic を を clear に 観 examine で き が, 氷 embedding method で は very な コ ン ト ラ ス ト は must ら れ な か っ た. Now the エネ ギ ギ フィ フィ タ顕 タ顕 microscope を uses the エネ て観 to examine the て る る る る. Fresh state に nearly い と こ ろ で DNA/RNAP complex を 観 examine し た い と え test more な る method を exam え で あ る. こ こ で は こ れ ま で に Ming ら か に な っ た low Angle back to the planning method of steamed に よ る results を concise に す. More nonspecific complex で は く の RNAP が DNA に pay the す る が, contact で は な く embrace え 込 む よ う に combining し て い る. ま た, RNAP の combined with direction が ま ち ま ち で あ る こ と か ら, DNA と RNAP と の combining に は back planning direction の freedom が あ り, mRNA synthesis に RNAP が back planning し な が ら for し て い を る possibility in stopping し た. Large Open complex complex の morphology な き な, 徴 は RNAP を vertex と し て DNA が fold り qu げ ら れ る こ と で あ る が, よ く 観 examine す る と 3 'side の DNA が RNAP か ら out る と こ ろ で さ ら に strong い kink が recognize め ら れ る. RNAP は big き な サ ブ ユ ニ ッ ト 2 small と さ な サ ブ ユ ニ ッ ト 2 が heavy な り あ っ た tectonic と し て see え る. そ し て DNA は RNAP の 2 2 alpha beta と と の に formed between さ れ る big き な チ ャ ン ネ ル を Ming ら か に transfixion し て い る. Elongation Complex で は short く て fine い mRNA が と alpha beta と の between の チ ャ ン ネ ル か ら テ ン プ レ ー ト DNA と と も に out て く る と こ ろ が 観 examine さ れ た が, RNAP が プ ロ モ ー タ ー を の position from れ て し ま う た め, synthesis mRNA が RNAP の 3 'side の り か 5' mouth side の export か ら out て く る の か は Does not だ confirm で な な だ だ.

项目成果

Usukura J: "Direct imaging of phosphorylation-dependent conformational change and DNA binding of CREB by electron microscopy"Genes to Cells. (in press). (2000)

Usukura J：“通过电子显微镜直接成像磷酸化依赖性构象变化和 CREB ​​的 DNA 结合”基因到细胞。

Hirako,Y.: "Cleavage of BP, a 180kDa bullous pemphigoid antigens, yields a 120 kDa collagenous extracelluar polypeptide." J.Biol.Chem.273. 9711-9717 (1998)

Hirako,Y.：“BP（一种 180kDa 大疱性类天疱疮抗原）的裂解产生 120kDa 胶原细胞外多肽。”