Development and dissemination of unroof and perforation methods for cryo-EM and AFM

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細胞膜を引き剥がす方法として、アンルーフ法を開発、改良した。これまでは細胞膜の細胞質側表面(内表面)、特に細胞膜の裏打ち構造を形態的に観察する方法がなかった。膜の裏打ち構造は情報伝達やウイルスなど感染過程において重要な役目を担っているにもかかわらず、機能と構造を結びつけられずにいた。そこで、我々は膜を剥がしてその内表面を観察するということを考えた。培養細胞の腹側細胞膜の裏打ち構造の観察には弱い超音波を用いて、背側の細胞膜および細胞質を除去し、腹側細胞膜の裏打ち構造を露出させ観察する方法（sonication method、超音波法)と接着性を高めたカバーガラスを背側細胞膜に押し当てた後、これを引き剥がし、背側細胞膜の裏打ち構造を観察する方法（adhesion method、接着法)を開発した。アンルーフは元々フリーズエッチングレプリカ法を経て細胞膜の裏打ち構造を電子顕微鏡(電顕)観察するために開発した方法であるが、我々はこれをクライオ電子顕微鏡(電顕)観察の試料作製にも応用した。アンルーフすることで細胞質が多少残っても、細胞全体の厚さは300nm以下となり、液体窒素で冷却した液体エタンへ浸漬凍結であっても十分な急速凍結となる。実際、30000倍では氷晶は確認されなかった。そして、新鮮状態の膜細胞骨格を観察することに成功した。また、この方法は原理的に考え、様々な顕微鏡観察のための試料作製に役立つと考え、その普及と発展に努力している。我々は原子間力顕微鏡にも適用し、カベオラ、クラスリンコートを水中で電子顕微鏡と同等の分解能で観察できた。これは水分を含んだ試料を高分解能で観察したという画期的な出来事であった。また、現在行っているインフルエンザウイルスの感染後の子孫ウイルスも出芽に際してゲノムパッケージングが細胞膜内表面で行われることもアンルーフ法によって明らかになった。