遺伝子転写過程のイメージングによる解析

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本研究は遺伝子の転写過程の形態学的側面を明らかにすることを目的として着手した。すなわち、大腸菌のDNAにポリメラーゼがどのように結合し、どのように転写をおこなうかをイメージングする。具体的には大腸菌のlacUV5のプロモーターを含む約1000ベースのDNAをテンプレートとして、DNA/ポリメラーゼ複合体のClosed complex,Opencomplex,Initiation complex,Elongation complexを低角度回転蒸着法により電子顕微鏡下で直接観察しその形態的相違点を明らかにした。この実験系ではヘパリンの存在下でのみ特異的な複合体形成が見られる。ヘパリンがない状態ではポリメラーゼは非特異的にDNAに結合する。この結合はただDNAに付着しいるのではなく、明らかにポリメラーゼはDNAを包み込んでいた。したがって、プロモーター部分に結合したポリメラーゼのみがOpen complexを形成し、他はいわゆるClosed complexの状態と考えられる。ヘパリンの添加によりOpen complexのみが残され、ほかのClosed complexは遊離する。この状態でポリメラーゼとDNAの結合を詳しく観察すると、DNAはポリメラーゼのαα,ββ'サブユニット間に形成される大きなチャンネルを貫通していることがわかった。また、3'側で大きくkinkしていることが明らかとなった。このような状態に3NTPを添加するとInitation complexへと移行するが、Open complexと形態的な違いを見つけだすことはできなかった。また、さらに4NTPを添加しElongation complexとすると実際にmRNAが合成されるところを画像的に捉えることができた。