癌関連蛋白のリン酸化異常を検出する酵母アッセイ法の開発

开发酵母检测方法来检测癌症相关蛋白的异常磷酸化

• 批准号: 11140202
• 负责人: 浜田 淳一
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11140202/
• 关键词: 酵母アッセイ法; Wntシグナル; β-カテニン; リン酸化; APC; TCF-4; アキシン

β-カテニンのリン酸化異常を検出する酵母アッセイ法を開発するために、Wntシグナル伝達経路の酵母細胞内での再構成を試みた。1.酵母染色体DNAへのレポータ遺伝子の導入βカテニン・TCF-4複合体が標的遺伝子の転写を活性化する際、その遺伝子のプロモーター領域にあるTCF-binding element(TBE)に結合する。このTBEの下流にADE2遺伝子を連結したレポーター遺伝子を作製し、酵母の染色体に組み込んだ。2.β-カテニン、アキシン、APC、TCF-4の酵母内発現ベクターの作製宿主にはヒスチジン(His)、トリプトファン(Trp)、ロイシン(Leu)等の栄養要求性変異を有する酵母株を用いた。酵母発現ベクターにはそれぞれのアミノ酸非要求性となる遺伝子を組込んだ3種類のベクターを使用した。ガラクトース添加培地でのみ転写がおこるようにプロモーターにはGAL1を用い、その下流にβ-カテニン、アキシン、APCあるいはTCF-4の全長cDNAを組込んだ。次に各々のベクターを単独で酵母に導入し、ガラクトース存在下で蛋白発現が誘導されることをウエスタンブロット法で確認した。3.レポーター遺伝子導入酵母でのβ-カテニンとTCF-4の発現上記1で作製したレポーター遺伝子導入酵母株に2で作製したβ-カテニン発現ベクターとTCF-4発現ベクターの両方を導入した。免疫沈降法とウエスタンブロット法の解析により、酵母内でのβ-カテニンとTCF-4複合体の形成が確認された。以上、Wntシグナル伝達経路に関与する分子を酵母内で発現させることに成功した。次のステップとして、これらの分子間相互作用の解析が必要となる。

Beta カ テ ニ ン の リ ン acidification abnormal を 検 out す る yeast ア ッ セ イ method を open 発 す る た め に, Wnt シ グ ナ ル 伝 da 経 road の yeast cells で の constitute を try again み た. 1. Yeast chromosome DNA へ の レ ポ ー タ posthumous son 伝 の import beta カ テ ニ ン, TCF - 4 complex が mark heritage 伝 son の planning write を activeness す る interstate, そ の posthumous son 伝 の プ ロ モ ー タ ー field に あ る TCF - binding element (TBE) に す る. こ の TBE の obscene に ADE2 posthumous son 伝 を link し た レ ポ ー タ ー heritage の を son 伝 し, yeast chromosome に group み 込 ん だ. 2. Beta カ テ ニ ン, ア キ シ ン, APC, TCF - 4 の yeast 発 now ベ ク タ ー の cropping host に は ヒ ス チ ジ ン (ihs), ト リ プ ト フ ァ ン (Trp), ロ イ シ ン (Leu) の tech students.their ownship have sex - different を have す る yeast strains を with い た. Yeast 発 now ベ ク タ ー に は そ れ ぞ れ の ア ミ ノ acid non requirements と な る heritage 伝 son を group 込 ん だ 3 kinds の ベ ク タ ー を use し た. ガ ラ ク ト ー ス add the petty で の み planning write が お こ る よ う に プ ロ モ ー タ ー に は GAL1 を い, そ の obscene に beta カ テ ニ ン, ア キ シ ン, APC あ る い は TCF - 4 の length cDNA を group 込 ん だ. に each 々 の ベ ク タ ー を 単 で yeast alone に import し, ガ ラ ク ト ー ス で proteins in the presence of 発 now が induced さ れ る こ と を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト method で confirm し た. 3. レ ポ ー タ ー posthumous son 伝 import yeast で の beta カ テ ニ ン と TCF - 4 の 発 now written 1 で cropping し た レ ポ ー タ ー heritage 伝 system import yeast strains に 2 で son し た beta カ テ ニ ン 発 now ベ ク タ ー と TCF - 4 発 now ベ ク タ ー の struck party を import し た. Immune sink method と ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト method の に よ り, yeast で の beta カ テ ニ ン と TCF - 4 complex の form が confirm さ れ た. Above, Wnt シ グ ナ ル 伝 da 経 road に masato and す る molecules within を yeast で 発 now さ せ る こ と に successful し た. The が necessary となる for the analysis of the intermolecular interactions of <s:1> ステップと ステップと て and <s:1> れら <s:1>.

项目成果

浜田淳一,守内哲也他: "Somatic mutations of the APC gene in primary breast cancers"Am.J.Pathol.. (印刷中).

Junichi Hamada、Tetsuya Moriuchi 等人：“原发性乳腺癌中 APC 基因的体细胞突变”Am.J. Pathol..（出版中）。

浜田淳一、守内哲也他: "Increased E1AF expression in mouse fibrosarcoma promotes metastasis through induction of MT1-MMP expression"Oncogene. 18. 1771-1776 (1999)

Junichi Hamada、Tetsuya Moriuchi 等人：“小鼠纤维肉瘤中 E1AF 表达增加通过诱导 MT1-MMP 表达促进转移”Oncogene。18. 1771-1776 (1999)

浜田淳一,守内哲也他: "A functional and quantitative mutational analysis of p53 mutations in yeast indicates strand biases and different roles of mutations in DMBA- and"Int.J.Cancer. 83. 700-705 (1999)

Junichi Hamada、Tetsuya Moriuchi 等人：“酵母中 p53 突变的功能和定量突变分析表明 DMBA 中的链偏向和突变的不同作用”Int.J.Cancer 83. 700-705 (1999)

浜田淳一,守内哲也他: "Transcriptional slippage of p53 gene enhanced by cellular damage in rat liver : monitoring the slippage by a yeast functional assay"Mutation Res.. (印刷中).

Junichi Hamada、Tetsuya Moriuchi 等人：“大鼠肝脏细胞损伤增强 p53 基因的转录滑移：通过酵母功能测定监测滑移”Mutation Res..（出版中）。

浜田淳一,守内哲也他: "Distinct prognostic values of p53 mutation and loss of estrogen receptor, and their cumulative effect in primary breast cancers"Int.J.Cancer. (印刷中).

Junichi Hamada、Tetsuya Moriuchi 等人：“p53 突变和雌激素受体缺失的独特预后价值及其在原发性乳腺癌中的累积效应”Int.J.Cancer（出版中）。